Стратегия биосенсорного анализа высокой пропускной способности и биоинформатики для глобальной проверки взаимодействий между наркотиками и белком
Summary
Это исследование было направлено на представление стратегии для выявления лекарственно-пептидных взаимодействий. Стратегия включает в себя биопанирование лекарственных признанных коротких пептидов на основе кварцево-кристаллического микробаланса (ККМ) биосенсора, а затем биоинформатический анализ для количественной оценки информации, полученной для распознавания наркотиков и аннотации лекарственных обязательных участков на белках.
Abstract
Рецепторы и ферментные белки являются важными биомолекулами, которые действуют как связывающие мишени для биологически активных малых молекул. Таким образом, быстрая и глобальная проверка лекарственно-белковых взаимодействий крайне желательна не только для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе терапевтической эффективности, но и для оценки характеристик препарата, таких как адсортация, распределение, обмен веществ, выделение и токсичность (ADMET) для клинического использования. Здесь мы представляем биосенсорную стратегию высокой пропускной способности для биопанирования коротких пептидов T7, которые легко отображаются на фаговом капсиде. Также показан последующий анализ аминокислотных последовательностей пептидов, содержащих короткие сегменты, как “сломанные реликвии”, лекарственных обязательных участков с использованием программ биоинформатики в рецепторном лиганд-контакте (RELIC). Применяя этот метод к двум клинически одобренным препаратам, антиопухольцумный иринотекан и противофлю осельтамивир, подробный процесс сбора лекарственных пептидных последовательностей и выделения обязательных для наркотиков участков целевых белков объясняется в этой статье. Стратегия, описанная в этом, может быть применена для любых небольших молекул, представляющих интерес.
Introduction
Выявление целей, связанных с лекарственными препаратами, имеет важное значение для разработки лекарственных средств, а также для понимания молекулярных механизмов заболеваний. В частности, рецепторы и ферментные белки являются наиболее важными молекулярными целями биологически активных малых молекул1. Хотя сродство захвата является устоявшейся техникой длявыявления наркотиковсвязывания белков 2 , технические ограничения, такие как низкая солуство белков, часто препятствуют проверке наркотиков целей2. Самое главное, обездвиженые малые молекулы теряют степень свободы, необходимую для стыковки, и могут быть недоступны для внутренне расположенных связывающих участков на более крупных целевых белках. Кроме того, неправильное срасчет белка, неспособность анализировать условия совместной кристаллизации и ограничения из-за молекулярных размеров часто препятствуют использованию рентгеновской кристаллографии, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и других подобных экспериментальных анализов для изучения лекарственно-белковых взаимодействий.
Использование биопаннинга дисплея T7 является эффективным способом определения места связывания белков для небольших молекул приманки3. В частности, эффективна библиотека случайных пептидов T7, которая может быть построена путем вставки синтетической ДНК в место мульти клонирования. По сравнению с библиотекой фагов T7, отображая белки, короткие пептиды могут быть легко спроектированы, чтобы отображаться на капсиде фагов T7 без физических ограничений, которые могут стерически контактировать с любым небольшим молекулой препарата, закрепленного на твердойподдержке 2. Кроме того, введение кварцево-кристаллического микробаланса (ККМ) биосенсора в биопанинговую платформу T7 phage позволяет идентифицировать такиеслабые,но специфические взаимодействия коротких пептидов с препаратами, отслеживая снижениечастоты ККМ 4,5. Связанный T7 фаг затем непосредственно восстанавливается путем заражения хозяина Escherichia coli (BLT5615), и определяется последовательность ДНК региона, которая кодирует выбранный сродством пептид, укрывательство наркотиков, распознающих короткие сегменты. Последующий анализ аминокислотной последовательности пептидной популяции дает информацию о распознавании наркотиков. В silico pairwise выравнивание спасенных аминокислотных последовательностей может быть использовано для получения информации о биологической цели препарата в выбранном протеоме. Эта высокая пропускная способность идентификации фрагментов белка с сродством к препарату может быть использована для heuristically реконструировать наркотиков связывания сайта таким образом, как реконструкция древнего артефакта из керамикиосколки 6. В частности, этот уникальный подход может быть полезен, когда обычные подходы протеомика терпят неудачу.
Здесь мы представляем биосенсорную стратегию биопанизации пептидов T7 и анализ биоинформатики для целевой проверки малых молекул. Помимо технических ограничений на традиционные методы, эта стратегия позволяет идентифицировать обязательные для наркотиков участки на целевых белках для любой небольшой молекулы, представляющие интерес в соответствии с идентичным протоколом.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь была представлена стратегия биосенсорной биопанации пептидов, распознающих наркотики, а затем биоинформатический анализ для проверки взаимодействий между наркотиками и белками с использованием выявленных пептидов. Проектирование малых производных молекулы для иммобилизации на золотом электроде биосенсора является важным шагом, так как введенный связующий может препятствовать связыванию и сбору пептида, который распознает препарат. Чтобы избежать этого, производные с различными позициями введенного связующим звеном готовятся23. Кроме того, для обездвиживания гидрофобных малых молекул, датчик чип погружается в навалом воды в 10 см Петри блюдо, и 20 йл раствор небольшой молекулы (10 мМ раствор в диметил сульфоксид) упал на золотой электрод биосенсора, чтобы покрыть его поверхность, и инкубируется в течение 5 мин. Это позволяет сохранить подсоти герц внутреннюю частоту малых молекул, которая проводится в течение по крайней мере 10 минут во время биопанирования. Действительно, используя такую иммобилизацию, Osel сродства выбранных пептидов четко подчеркнул Озель связывания сайта в NA (Рисунок 3).
T7 фаг используется для подготовки пептид библиотеки здесь генетически инженерии с использованием NNK15 кассеты, которая кодирует 32 кодонов для всех 20 стандартных аминокислот и подавляет появление 2 стоп кодонов (UAA, UGA) и возникает только UAG (Рисунок 1)6,7. Это важно для отображения 15-мер полнометражных пептидов и увеличения разнообразия библиотеки. Система отображения фагов T7 имеет технический предел дисплея 107-109 фагов T7. Тем не менее, разнообразие 15-мер пептид библиотеки теоретически 2015 (3,27 × 1019); таким образом, он не может быть использован для полного строительства библиотеки. Тем не менее, поиск сходства или добыча сохраненных мотивов позволяет обнаруживать аминокислоты, состоящие из обязательных для наркотиков мест белков даже при этом ограниченном разнообразии пептидов в библиотеке. Кроме того, 3-5 аминокислоты простирается в библиотеке пептид (скорость появления между 1/203 и 1/ 205, которые могут быть реализованы с помощью системы отображения T7 фаг) участвуют в признании малых молекул наркотиков; таким образом, 100% совпадение пептидных последовательностей с 15-мер аминокислотных последовательностей, составляющих препарат связывания сайта целевого белка не требуется. Действительно, приблизительно 30 пептидов, выбранных сродством, успешно выделили связывающее место целевого белка для каждого испытанного препарата(рисунок 4). Таким образом, разнообразие используемой родительской фаговой библиотеки T7 (1.7 × 107 pfu/mL) может быть использовано для heuristically реконструкции лекарственно-связывающего участка.
Как правило, 3-5 копий T7 фагов, которые отображаются те же последовательности, как у 15-мер аминокислотных последовательностей укрывательство наркотиков признания аминокислоты простирается появились в пределах 16 бляшек произвольно изолированы, что свидетельствует об успехе сродства выбор в соответствии с нашим протоколом. Это указывает на то, что 18–30 различных пептидных последовательностей, распознающих наркотики, собираются в изолированных 96 бляшках (число связано с форматом микропластицы), которые впоследствии идентифицируются с помощью секвенирования ДНК и получения соответствующей аминокислотной последовательности. В настоящей стратегии инъекция 8 МКЛ библиотеки фагов T7 в кюветт, содержащую 8 мл буфера (1000-кратное разбавление библиотеки), подходит для уменьшения неспецифической привязки фагов T7. Для увеличения разнообразия сродства выбранных пептидов, повторяя один цикл выбора несколько раз и с помощью 16 или 32 бляшек изоляции на скрининг оказался более эффективным, чем изоляция от одного решения в то время. Например, для эффективного сбора примерно 30 по-разному секвенируемых пептидов, выбранных сродством, было проведено 3-6 наборов одного цикла отбора, в каждом эксперименте было выделено 16 или 32 бляшек. Появление идентичных последовательностей во всех 16 или 32 фаговых бляшках T7 указывается случайным обнаружением фона или может быть загрязнено в качестве переноски. В отличие от этого, отсутствие T7 фагов с той же последовательностью или появление многих магов T7 с более короткими пептидами, чем длина 15 мер указывает на то, что T7 фагов в популяции не специально появились с высокой вероятностью. Поскольку снижение частоты ККМ происходит в той же степени даже в таких случаях, успех отбора должен быть всесторонне оценен путем секвенирования ДНК изолированного фаго T7, а затем биоинформатический анализ аминокислотных последовательностей пептидов. Кроме того, в отличие от обычного протокола отображения фагов T7, повторные раунды отбора менее эффективны, так как вариация и количество фагов T7 малы и не сконцентрированы даже после повторения шагов усиления и отбора23.
Важно отметить, что этот метод применим для добычи небольших молекул-связывающих участков в протеомах человека, патогенных вирусах и даже растениях. Интересно, что возможно неструктурированный короткий дисплей длины пептидов на T7 фаг капсид может имитировать молекулярную динамику пептидов белков во время стыковки с небольшой молекулой; это может отражать динамическоесвязывание 24. Помимо технических ограничений обычных методов, эта стратегия, применимая к идентичным протоколам для малых молекул, может расширить наркотический протеом, а также обеспечить больше детализации в отношении анализа взаимодействия между наркотиками и белком.
Следует рассмотреть некоторые технические ограничения такого подхода. Органический синтез необходим для иммобилизации малых молекул на поверхности золотого электрода биосенсорного чипа. Для не-экспертов в органической химии, некоторые реагенты иммобилизации коммерчески доступны для механического исправления небольшой молекулы путем соединения. Кроме того, некоторые глупости части пептидов может привести к обнаружению часть белка не имеет отношения к препарату стыковки в качестве ложных срабатываний. Это соответствует эмпирически бета-лист или лейцин богатых доменов, богатых лейцином или валиновых остатков, которые кодируются более кодонов, чем другие стандартные аминокислоты, когда копии мага T7 производятся. Контроль длины пептида библиотеки может контролировать возникновение ложных срабатываний. В отличие от этого, могут быть случаи, когда аминокислотные остатки в лекарственно-связывающем участке, которые участвуют в стыковке, как это попродемонстрировано с помощью рентгеновской кристаллографии или анализа ЯМР, не обнаруживаются. Это может быть решена путем сбора большего числа наркотиков признания пептидов или изменения направления фиксации малых молекул на золотой электрод.
Многие лекарственно-белковые взаимодействия, связанные с основными и вторичными последствиями употребления наркотиков, еще могут быть неопознанными в протеоме; кроме того, ферменты и транспортеры, ответственные за поглощение, распределение наркотиков, обмен веществ, выделение и токсичность, также могут быть еще неопознанными. Связывание белков не всегда отвечает за биоактивность препарата. Таким образом, сочетание другой информации, полученной в результате биологических анализов, позволит улучшить выявление основных целей в области наркотиков, отвечающих за основные и неблагоприятные последствия наркотиков. Дальнейшая адаптация этого краткого метода повысит практичность и пропускную способность для добычи белково-связывающих участков широкого спектра мелких молекулярных препаратов. Представленный в нем метод в значительной степени будет способствовать не только проведению фундаментальных исследований в смежных областях, но и уточнению молекулярных механизмов, лежащих в основе терапевтической эффективности или других биологических эффектов препаратов в клиническом использовании.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Автор благодарит д-ра Yujiro Хаяси и Хаято Исикаву за предоставление осельтамивира, а д-ра Ли Маковски за предоставление автономных программ RELIC. Автор также признает Тэцуя Кавагоэ за техническую помощь в эксперименте ККМ. Эта работа была частично поддержана JSPS KAKENHI Грант номер 17K01363 (Y.T.).
ЗАЯВЛЕНИЕ О ДОСТУПНОСТИ ДАННЫХ
Отдельные программы RELIC и данные последовательности выбранных сродства пептидов для лекарств, а также белковые последовательности из базы данных протеомов, используемых в этой статье, доступны у этого автора по запросу (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).
Materials
| AFFINIXQN | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCM2008-STKIT | Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC |
| AADIV | Northeastern University (Lee Makowski) |
AADIV.exe | Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library. |
| Ceramic Sensor Chip | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMST27C | 4 sensor chips/package |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
D8418 | |
| Ethanol | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 09-0850 | |
| FASTAcon | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAcon.exe | Identifies proteins from a population with short consensus sequences. |
| FASTAskan | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAskan.exe | Lists proteins with high similarity to a peptide population. |
| Immiblization kit for AFFINIX | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMIMKT | SAM reagent and amine coupling reagent |
| INFO | Northeastern University (Lee Makowski) |
INFO.exe | Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule). |
| Liguid LB medium | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
L3522 | Autoclave for 20 min |
| MATCH | Northeastern University (Lee Makowski) |
MATCH.exe | Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length). |
| MOTIF1 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF1.exe | Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population. |
| MOTIF2 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF2.exe | Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths. |
| NaCl | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | S3014 | |
| Recptor ligand contacts (RELIC) | Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA) |
https://www.relic.anl.gov | Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request) |
| Tris | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 252859 |
References
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack. Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Piggott, A. M., Karuso, P. Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display. Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule. Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).
- Takakusagi, Y., et al. Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display. ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).
- Novagen. T7 Select® System Manual. Novagen. , (2009).
- Novagen. OrientExpressTM cDNA Manual. Novagen. , (2009).
- Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. RELIC–a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites. Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).
- Makowski, L., Petrenko, V. A., Smith, G. P. . Phage Nanobiotechnology. , 33-54 (2011).
- Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins. Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).
- Harel, M., et al. The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action. Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).
- Dodds, H. M., Rivory, L. P. The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11). Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).
- Bencharit, S., et al. Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases. Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).
- Kim, C. U., et al. Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity. Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).
- Hoffmann, G., et al. Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).
- Wishart, D. S., et al. DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018. Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).
- Takakusagi, K., et al. Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).
- Takakusagi, Y., et al. Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).
- Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device. World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).
- Kusayanagi, T., et al. The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).
- Takakusagi, Y., et al. Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).
- Rodi, D. J., et al. Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).
