Estratégia de análise de biopanning e bioinformática baseada em biosensor para a validação global de interações medicamentosas-proteínas

Aqui, foi apresentada uma estratégia para o biopanning baseado em biosensor de peptídeos que reconhecem drogas, seguida de análise bioinformática para validação de interações medicamentosa-proteína usando os peptídeos identificados. Projetar os derivados de pequenas moléculas para imobilização no eletrodo de ouro do biosensor é um passo importante, pois o linker introduzido pode dificultar a ligação e a coleta do peptídeo que reconhece a droga. Para evitar isso, derivativos com diferentes posições do linker introduzido são preparados²³. Alternativamente, para imobilizar pequenas moléculas hidrofóbicas, o chip do sensor é imerso em água a granel em uma placa de Petri de 10 cm, e uma solução de 20 μL da pequena molécula (solução de 10 mM em sulfóxido de dimetila) é lançada sobre o eletrodo de ouro do biosensor, para cobrir sua superfície, e incubada por 5 minutos. Isso permite a retenção de uma frequência intrínseca de hertz sub-cem de pequenas moléculas, que é mantida por pelo menos 10 minutos durante o biopanning. De fato, utilizando tal imobilização, os peptídeos selecionados pela afinidade osel destacaram claramente o local de vinculação de Osel em NA (Figura 3).

O phage T7 usado para preparar a biblioteca de peptídeos aqui é geneticamente modificado usando o NNK₁₅ que codifica 32 códons para todos os 20 aminoácidos padrão e reprime o surgimento de 2 códons de parada (UAA, UGA) e emerge apenas UAG (Figura 1)^6,7. Isso é importante para exibir peptídeos de 15-mer e aumentar a diversidade da biblioteca. O sistema de exibição de phage T7 tem um limite técnico de exibição de 10⁷—10⁹ phages T7. No entanto, a diversidade da biblioteca de peptídeos de 15-mer é teoricamente 20¹⁵ (3,27 × 10¹⁹); assim, não pode ser usado para construção completa da biblioteca. No entanto, a busca por similaridade ou mineração de motivos conservados permite a detecção dos aminoácidos que compreendem os locais de ligação de drogas de proteínas, mesmo com essa limitada diversidade de peptídeos na biblioteca. Além disso, 3-5 aminoácidos se estendem dentro do peptídeo da biblioteca (a taxa de aparência é entre 1/20³ e 1/ 20⁵, que pode ser realizado usando o sistema de exibição de phage T7) estão envolvidos no reconhecimento de pequenas moléculas drogas; portanto, não é necessário um 100% de correspondência das sequências de peptídeos com sequências de aminoácidos de 15-mer que constituem o local de ligação medicamentosa da proteína alvo. De fato, aproximadamente 30 peptídeos selecionados por afinidade destacaram com sucesso o local de ligação da proteína alvo para cada droga testada(Figura 4). Assim, a diversidade da biblioteca de phage T7 pai utilizada (1,7 × 10⁷ pfu/mL) pode ser usada para reconstruir heuristicamente o local de ligação de drogas.

Tipicamente, 3-5 cópias de phages T7 que exibiam as mesmas sequências das sequências de aminoácidos de 15-mer que abrigam trechos de aminoácidos que reconhecem drogas surgiram dentro das 16 placas arbitrariamente isoladas, indicando o sucesso da seleção de afinidade sob nosso protocolo. Isso indica que 18-30 sequências diferentes de peptídeos que reconhecem drogas são coletadas dentro das 96 placas isoladas (o número está associado ao formato microplaca), que são identificados posteriormente usando sequenciamento do DNA e obtenção da sequência de aminoácidos correspondente. Na estratégia atual, a injeção de 8 μL da biblioteca de phage T7 no cuvette contendo tampão de 8 mL (diluição de 1000 vezes da biblioteca) é adequada para reduzir a ligação não específica de phages T7. Para aumentar a diversidade dos peptídeos selecionados por afinidade, repetir a seleção de um ciclo várias vezes e usar 16 ou 32 isolamentos de placas por triagem mostrou-se mais eficaz do que o isolamento de uma única solução de cada vez. Por exemplo, para coletar efetivamente aproximadamente 30 peptídeos selecionados por afinidade sequenciados de forma diferente, foram realizados 3-6 conjuntos de seleção de um ciclo, 16 ou 32 placas foram isoladas em cada experimento. A aparência de sequências idênticas em todas as placas de 16 ou 32 placas de phage T7 são indicadas detecção acidental de fundo ou pode contaminar como uma transferência. Em contraste, a ausência de phages T7 com a mesma sequência ou aparência de muitos phages T7 com peptídeos mais curtos do que o comprimento de 15-mer indica que os phages T7 na população não especificamente emergiram com alta probabilidade. Como a redução da frequência do QCM ocorre na mesma medida mesmo nesses casos, o sucesso da seleção deve ser amplamente avaliado sequenciando o DNA da praga isolada T7, seguida pela análise bioinformática das sequências de aminoácidos dos peptídeos. Além disso, ao contrário do protocolo convencional de exibição de phage T7, repetir rodadas de seleção é menos eficaz, pois a variação e o número dos phages T7 são pequenos e não estão concentrados mesmo após a repetição das etapas de amplificação e seleção²³.

É importante ressaltar que este método é aplicável para a mineração de pequenos sítios de ligação de moléculas nos proteomes de humanos, vírus patogênicos e até plantas. Curiosamente, o comprimento de exibição curta possivelmente não estruturado de peptídeos no capsídeo de phage T7 pode imitar a dinâmica molecular dos peptídeos de proteínas durante o acoplamento com uma pequena molécula; isso pode refletir a ligação dinâmica²⁴. Além das limitações técnicas dos métodos convencionais, essa estratégia, aplicável a protocolos idênticos para pequenas moléculas, pode expandir o proteome drogado, bem como proporcionar mais granularidade em relação à análise de interação drogada-proteína.

Algumas limitações técnicas dessa abordagem devem ser consideradas. A síntese orgânica é necessária para a imobilização de pequenas moléculas na superfície do eletrodo de ouro do chip biosensor. Para os não especialistas em química orgânica, alguns reagentes de imobilização estão disponíveis comercialmente para fixar mecanicamente a pequena molécula por acoplamento. Além disso, certas porções sem sentido dos peptídeos podem resultar na detecção de uma porção da proteína não relevante para o acoplamento de drogas como falsos positivos. Isso corresponde empiricamente a domínios ricos em folha beta ou leucinas ricos em resíduos de leucina ou valina, que são codificados por mais códons do que outros aminoácidos padrão, quando cópias do phage T7 são produzidas. Controlar o comprimento do peptídeo da biblioteca pode controlar a ocorrência de falsos positivos. Em contraste, pode haver casos em que resíduos de aminoácidos no local de ligação de drogas que estão envolvidos no acoplamento, como demonstrado usando cristalografia de raios-X ou análise de RMN, não são detectados. Isso pode ser resolvido coletando um número maior dos peptídeos que reconhecem a droga ou mudando a direção da fixação das pequenas moléculas no eletrodo de ouro.

Muitas interações medicamentosa-proteínas que estão relacionadas aos principais e secundários efeitos do uso de drogas ainda podem não ser identificadas no proteome; além disso, enzimas e transportadores responsáveis pela absorção de medicamentos, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade, também podem ainda não ser identificados. A ligação proteica nem sempre é responsável pela bioatividade de uma droga. Assim, uma combinação de outras informações de ensaios biológicos melhorará a identificação de alvos essenciais de drogas responsáveis pelos principais e adversos efeitos das drogas. Outras adaptações desta técnica concisa aumentarão a praticidade e o throughput para a mineração dos locais de ligação proteica de uma ampla gama de pequenas moléculas. O método aqui apresentado contribuirá em grande parte para não apenas realizar pesquisas básicas nos campos relacionados, mas também esclarecer os mecanismos moleculares subjacentes à eficácia terapêutica ou outros efeitos biológicos de drogas no uso clínico.