Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alta produttività basata su biosensore per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina

Qui è stata presentata una strategia per la biopanning a base di biosensore QCM dei peptidi che riconoscono i farmaci, seguita da un’analisi bioinformatica per la convalida delle interazioni farmaco-proteina utilizzando i peptidi identificati. Progettare i derivati delle piccole molecole per l’immobilizzazione sull’elettrodo d’oro del biosensore è un passo importante, in quanto il linker introdotto può ostacolare il legame e la raccolta del peptide che riconosce il farmaco. Per evitare questo, vengono preparate derivate con diverse posizioni del linker introdotto²³. In alternativa, per immobilizzare piccole molecole idrofobiche, il chip del sensore viene immerso nell’acqua sfusa in una piastra di Petri di 10 cm e una soluzione da 20 μL della piccola molecola (soluzione da 10 mM nel solfossido di dimetile) viene lasciata cadere sull’elettrodo d’oro del biosensore, per coprirne la superficie, e incubata per 5 minuti. Ciò consente la ritenzione di una frequenza intrinseca sottocento hertz di piccole molecole, che viene trattenuta per almeno 10 minuti durante la biopanning. Infatti, utilizzando tale immobilizzazione, i peptidi selezionati per l’affinità di Osel hanno evidenziato chiaramente il sito di legame dell’Osel nella NA (Figura 3).

Il fago T7 utilizzato per preparare la libreria peptidica qui è geneticamente modificato utilizzando la cassetta NNK₁₅ che codifica 32 codoni per tutti i 20 amminoacidi standard e reprime l’emergere di 2 codoni stop (UAA, UGA) ed emerge solo UAG(Figura 1)^6,7. Questo è importante per visualizzare peptidi a figura intera di 15 anni e aumentare la diversità della libreria. Il sistema di visualizzazione del fago T7 ha un limite tecnico di visualizzazione di^{10 7}-10⁹ fagi T7. Tuttavia, la diversità della libreria peptidica di 15 anni è teoricamente di 20¹⁵ (3,27 × 10^19); pertanto, non può essere utilizzato per la costruzione completa della biblioteca. Tuttavia, la ricerca di somiglianza o l’estrazione di motivi conservati consente di rilevare gli amminoacidi che comprendono i siti di legame farmacologico delle proteine anche con questa limitata diversità di peptidi in biblioteca. Inoltre, 3-5 amminoacidi si estendono all’interno del peptide della libreria (il tasso di aspetto è compreso tra 1/20³ e 1/ 20⁵, che può essere realizzato utilizzando il sistema di visualizzazione del fago T7) sono coinvolti nel riconoscimento di farmaci di piccole molecole; pertanto, non è necessaria una corrispondenza al 100% delle sequenze peptidiche con sequenze di amminoacidi 15-mer che costituiscono il sito di legame farmacologico della proteina bersaglio. Infatti, circa 30 peptidi selezionati per affinità hanno evidenziato con successo il sito di legame della proteina bersaglio per ciascun farmaco testato (Figura 4). Pertanto, la diversità della libreria di fagi T7 madre utilizzata (1,7 × 10⁷ pfu/mL) può essere utilizzata per ricostruire euristicamente il sito di legame farmacologico.

Tipicamente, 3-5 copie di fagi T7 che mostravano le stesse sequenze di quelle delle sequenze di amminoacidi di 15 anni che ospitavano tratti di amminoacidi che riconoscevano farmaci emersero all’interno delle 16 placche arbitrariamente isolate, indicando il successo della selezione di affinità secondo il nostro protocollo. Ciò indica che 18-30 diverse sequenze peptidiche che riconoscono i farmaci vengono raccolte all’interno delle 96 placche isolate (il numero è associato al formato micropiatta), che vengono identificate successivamente utilizzando il sequenziamento del DNA e ottenendo la corrispondente sequenza di amminoacidi. Nella strategia attuale, l’iniezione di 8 μL della libreria di fago T7 nella cuvetta contenente tampone da 8 mL (diluizione di 1000 volte della libreria) è adatta a ridurre il legame non specifico dei fagi T7. Per aumentare la diversità dei peptidi selezionati dall’affinità, ripetere più volte la selezione a un ciclo e utilizzare 16 o 32 isolamenti della placca per screening si è rivelato più efficace dell’isolamento da una singola soluzione alla volta. Ad esempio, per raccogliere efficacemente circa 30 peptidi selezionati dall’affinità sequenziati in modo diverso, sono stati condotti 3-6 set di selezione a un ciclo, 16 o 32 placche sono state isolate in ogni esperimento. L’aspetto di sequenze identiche in tutte le placche di fago 16 o 32 T7 è indicato come rilevamento accidentale dello sfondo o potrebbe contaminazione come riporto. Al contrario, l’assenza di fagi T7 con la stessa sequenza o comparsa di molti fagi T7 con peptidi più corti rispetto alla lunghezza di 15-mer indica che i fagi T7 nella popolazione non sono emersi specificamente con alta probabilità. Poiché la riduzione della frequenza QCM avviene nella stessa misura anche in questi casi, il successo della selezione dovrebbe essere valutato in modo completo sequenziando il DNA del fago T7 isolato, seguito dall’analisi bioinformatica delle sequenze amminoacidiche dei peptidi. Inoltre, a differenza del protocollo di visualizzazione del fago T7 convenzionale, i cicli ripetuti di selezione sono meno efficaci, in quanto la variazione e il numero dei fagi T7 sono piccoli e non si concentrano anche dopo aver ripetuto le fasi di amplificazione e^{selezione 23.}

È importante sottolineare che questo metodo è applicabile per l’estrazione di piccoli siti di legame molecolare nei proteomi dell’uomo, virus patogeni e persino piante. È interessante notare che la breve lunghezza di visualizzazione possibilmente non strutturata dei peptidi sul capsid del fago T7 può imitare la dinamica molecolare dei peptidi delle proteine durante l’aggancio con una piccola molecola; questo può riflettere l’associazione^{dinamica 24}. Oltre ai limiti tecnici dei metodi convenzionali, questa strategia, applicabile a protocolli identici per piccole molecole, può espandere il proteoma farmaco-beneficio e fornire una maggiore granularità per quanto riguarda l’analisi dell’interazione farmaco-proteina.

Si dovrebbero prendere in considerazione alcune limitazioni tecniche di questo approccio. La sintesi organica è necessaria per l’immobilizzazione di piccole molecole sulla superficie dell’elettrodo d’oro del chip del biosensore. Per i non esperti di chimica organica, alcuni reagenti di immobilizzazione sono commercialmente disponibili per fissare meccanicamente la piccola molecola accoppiando. Inoltre, alcune porzioni senza senso dei peptidi potrebbero comportare il rilevamento di una porzione della proteina non rilevante per l’attracco dei farmaci come falsi positivi. Ciò corrisponde empiricamente a domini ricchi di beta-fogli o leucine ricchi di leucina o residui di valine, che sono codificati da più codoni rispetto ad altri amminoacidi standard, quando vengono prodotte copie del fago T7. Il controllo della lunghezza peptidica della libreria potrebbe controllare il verificarsi di falsi positivi. Al contrario, ci possono essere casi in cui non vengono rilevati residui di amminoacidi nel sito di legame farmacologico coinvolti nell’attracco, come dimostrato utilizzando la cristallografia a raggi X o l’analisi NMR. Questo può essere risolto raccogliendo un maggior numero di peptidi che riconoscono il farmaco o cambiando la direzione di fissaggio delle piccole molecole sull’elettrodo d’oro.

Molte interazioni farmaco-proteina correlate ai principali e secondari effetti del consumo di stupefacenti possono ancora non essere identificate nel proteoma; inoltre, anche gli enzimi e i trasportatori responsabili dell’assorbimento, della distribuzione, del metabolismo, dell’escrezione e della tossicità dei farmaci potrebbero non essere ancora identificati. Il legame proteico non è sempre responsabile della bioattività di un farmaco. Pertanto, una combinazione di altre informazioni provenienti da saggi biologici migliorerà l’identificazione degli obiettivi essenziali in materia di farmaci responsabili degli effetti principali e negativi dei farmaci. Ulteriori adattamenti di questa tecnica concisa aumenteranno la praticità e la produttività per l’estrazione dei siti di legame proteico di una vasta gamma di farmaci a piccole molecole. Il metodo qui presentato contribuirà in gran parte non solo a condurre ricerche di base nei campi correlati, ma chiarirà anche i meccanismi molecolari alla base dell’efficacia terapeutica o di altri effetti biologici dei farmaci nell’uso clinico.