ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

כאן, אסטרטגיה עבור biopanning מבוסס QCM biosensor של פפטידים זיהוי סמים, ואחריו ניתוח bioinformatics לאימות אינטראקציות חלבון תרופתי באמצעות פפטידים מזוהים, הוצג. תכנון נגזרות המולקולות הקטנות לשיתוק על אלקטרודת הזהב של הביוסנסור הוא צעד חשוב, שכן המקשר שהוצג עלול לעכב את הכריכה והאיסוף של הפפטיד שמכיר בתרופה. כדי למנוע זאת, נגזרים עם עמדות שונות של המקשר הציג מוכנים²³. לחלופין, לשיתוק מולקולות קטנות הידרופוביות, שבב החיישן שקוע במים בתפזורת בצלחת פטרי 10 ס”מ, ותמיסת 20 μL של המולקולה הקטנה (10 מ”מ פתרון דימתיל סולפוקסיד) הוא ירד על אלקטרודה הזהב של biosensor, כדי לכסות את פני השטח שלה, דגירה במשך 5 דקות. זה מאפשר שמירה של תת מאה הרץ תדר מהותי של מולקולות קטנות, אשר מוחזק לפחות 10 דקות במהלך הביופאנינג. ואכן, באמצעות קיבוע כזה, הפפטידים שנבחרו על ידי אוסל הדגישו בבירור את האתר המחייב את אוסל ב- NA (איור 3).

פאג’ T7 המשמש להכנת ספריית הפפטיד כאן מהונדס גנטית באמצעות קלטת NNK₁₅ המקודדת 32 קודונים לכל 20 חומצות האמינו הסטנדרטיות ומדחיקה את הופעתם של 2 קודונים עוצרים (UAA, UGA) ומגיחה רק UAG (איור 1)^6,7. זה חשוב להצגת פפטידים באורך מלא של 15 מר והגדלת המגוון של הספרייה. למערכת התצוגה T7 phage יש מגבלת תצוגה טכנית של 10⁷-10 9 פאג’ים T7. עם זאת, המגוון של ספריית פפטיד 15-mer הוא תיאורטית 20¹⁵ (3.27 × 10¹⁹); לפיכך, לא ניתן להשתמש בו לבניית ספריה מלאה. עם זאת, חיפוש דמיון או כרייה של מוטיבים שמורים מאפשרים זיהוי של חומצות האמינו המרכיבות את אתרי איגוד הסמים של חלבונים אפילו עם מגוון מוגבל זה של פפטידים בספרייה. בנוסף, 3-5 חומצות אמינו נמתח בתוך פפטיד הספרייה (שיעור המראה הוא בין 1/20³ ו 1/ 20⁵, אשר ניתן לממש באמצעות מערכת התצוגה פאג T7) מעורבים בזיהוי של תרופות מולקולה קטנה; לכן, התאמה של 100% של רצפי פפטיד עם רצפי חומצות אמינו 15-mer המהווים את האתר מחייב התרופה של חלבון היעד אינו נדרש. ואכן, כ-30 פפטידים שנבחרו על ידי זיקה הדגישו בהצלחה את האתר המחייב של חלבון היעד לכל תרופה שנבדקה (איור 4). לכן, המגוון של ספריית פאג ‘T7 האב בשימוש (1.7 × 10⁷ pfu / mL) ניתן להשתמש כדי לשחזר באופן היוריסטי את האתר מחייב סמים.

בדרך כלל, 3-5 עותקים של פאג’ים T7 שהציגו רצפים זהים לאלה של רצפי חומצות אמינו 15-mer מחסה חומצות אמינו זיהוי סמים מתיחות הופיעו בתוך 16 לוחות מבודדים באופן שרירותי, המציין את ההצלחה של בחירת הזיקה תחת הפרוטוקול שלנו. הדבר מצביע על כך ש-18-30 רצפי פפטיד שונים לזיהוי סמים נאספים בתוך 96 הלוחות המבודדים (המספר משויך לפורמט המיקרופלאט), המזוהים לאחר מכן באמצעות רצף של הדנ”א והשגת רצף חומצות האמינו המתאים. באסטרטגיה הנוכחית, הזרקה של 8 μL של ספריית פאג T7 לתוך cuvette המכיל 8 מאגר מ”ל (דילול פי 1000 של הספרייה) מתאים להפחתת כריכה לא ספציפית של פאג’ים T7. כדי להגדיל את המגוון של פפטידים שנבחרו זיקה, חוזר על בחירת מחזור אחד מספר פעמים ושימוש 16 או 32 בידודים פלאק לכל הקרנה הוכיח להיות יעיל יותר מאשר בידוד מפתרון אחד בכל פעם. לדוגמה, כדי לאסוף ביעילות כ-30 פפטידים שנבחרו על-ידי זיקה ברצף שונה, נערכו 3-6 סטים של בחירת מחזור אחד, 16 או 32 לוחות בודדו בכל ניסוי. מראה של רצפים זהים בכל 16 או 32 לוחות פאג ‘ T7 מסומנים זיהוי מקרי של רקע או עלול זיהום כמו carryover. לעומת זאת, היעדר פאג’ים T7 עם אותו רצף או מראה של פאג’ים T7 רבים עם פפטידים קצרים יותר מאשר אורך 15-mer מציין כי פאג’ים T7 באוכלוסייה לא במיוחד הופיעו עם הסתברות גבוהה. כמו הפחתת תדר QCM מתרחשת באותה מידה גם במקרים כאלה, ההצלחה של הבחירה צריכה להיות מוערכת באופן מקיף על ידי רצף ה- DNA של פאג T7 מבודד, ואחריו ניתוח bioinformatics של רצפי חומצות אמינו של פפטידים. יתר על כן, בניגוד לפרוטוקול התצוגה הקונבנציונלי T7 פאג ‘, סיבובים חוזרים של בחירה הוא פחות יעיל, כמו וריאציה ומספר פאג’ים T7 הם קטנים ואינם מרוכזים גם לאחר חזרה על הגברה וקטעי בחירה²³.

חשוב לציין, שיטה זו ישימה לכריית אתרים קטנים המחייבים מולקולות בפרוטומים של בני אדם, וירוסים פתוגניים ואפילו צמחים. מעניין, אורך התצוגה הקצרה אולי לא מובנה של פפטידים על קפסיד פאג T7 יכול לחקות את הדינמיקה המולקולרית של פפטידים של חלבונים במהלך עגינה עם מולקולה קטנה; פעולה זו יכולה לשקף איגוד דינאמי²⁴. מעבר למגבלות הטכניות של שיטות קונבנציונליות, אסטרטגיה זו, החלה על פרוטוקולים זהים למולקולות קטנות, עשויה להרחיב את הפרוטום הניתן לתרופה, כמו גם לספק צפיפות רבה יותר לגבי ניתוח אינטראקציה בין חלבונים תרופתיים.

יש לשקול מגבלות טכניות מסוימות של גישה זו. סינתזה אורגנית נחוצה לשיתוק מולקולה קטנה על פני השטח של אלקטרודה זהב של שבב biosensor. עבור מי שאינם מומחים בכימיה אורגנית, ריאגנטים מסוימים של קיבוע זמינים מסחרית כדי לתקן באופן מכני את המולקולה הקטנה על ידי צימוד. יתר על כן, חלקים מסוימים שטויות של פפטידים עלול לגרום לגילוי של חלק של החלבון לא רלוונטי עבור עגינה סמים כמו חיובי כוזב. זה מתאים באופן אמפירי לתחומים עשירים בגיליון בטא או לאוצין עשירים בשאריות לאוצין או ואלין, המקודדים על ידי יותר קודונים מאשר חומצות אמינו סטנדרטיות אחרות, כאשר עותקים של פאג ‘T7 מיוצרים. שליטה באורך פפטיד הספריה עשויה לשלוט במופע של תוצאות חיוביות שגויות. לעומת זאת, ייתכנו מקרים שבהם שאריות חומצות אמינו באתר מחייב הסמים המעורבים בעגינה, כפי שהוכח באמצעות קריסטלוגרפיה רנטגן או ניתוח NMR, אינם מזוהים. זה עשוי להיפתר על ידי איסוף מספר גדול יותר של פפטידים זיהוי סמים או שינוי הכיוון של תיקון של מולקולות קטנות על אלקטרודה זהב.

אינטראקציות רבות של חלבונים תרופתיים הקשורות להשפעות העיקריות והמשניות של השימוש בסמים עדיין עשויות להיות בלתי מזוהות בפרוטאום; בנוסף, אנזימים ומשגרים האחראים לספיגת תרופות, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה ורעילות, עשויים גם הם להיות עדיין בלתי מזוהים. חלבון מחייב לא תמיד אחראי על ביואקטיביות של תרופה. לכן, שילוב של מידע אחר מן מבחנים ביולוגיים ישפר את הזיהוי של מטרות סמים חיוניים האחראים על ההשפעות העיקריות והתופעות השליליות של תרופות. התאמות נוספות של טכניקה תמציתית זו יגדילו את המעשיות והתפוקה לכריית אתרי מחייבי החלבון של מגוון רחב של תרופות מולקולות קטנות. השיטה המוצגת בזאת תתרום במידה רבה לא רק לביצוע מחקרים בסיסיים בתחומים הקשורים, אלא גם להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס היעילות הטיפולית או השפעות ביולוגיות אחרות של תרופות בשימוש קליני.