Biosensor-basierte Hochdurchsatz-Biopanning- und Bioinformatik-Analysestrategie zur globalen Validierung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen
Summary
Diese Studie zielte darauf ab, eine Strategie zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Peptid zu präsentieren. Die Strategie umfasst die Biopanierung von medikamentenerkennenden kurzinomischen Kurzpeptiden auf der Grundlage eines Mikrobilanzsensors (QCM) in Quarzkristall, gefolgt von einer Bioinformatik-Analyse zur quantitativen Bewertung der für die Arzneimittelerkennung und Anmerkung der Arzneimittelbindungsstellen auf Proteinen erhaltenen Informationen.
Abstract
Rezeptoren und Enzymproteine sind wichtige Biomoleküle, die als Bindungsziele für bioaktive kleine Moleküle fungieren. Daher ist die schnelle und globale Validierung der Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Protein enden sehr wünschenswert, um nicht nur die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der therapeutischen Wirksamkeit zugrunde liegen, sondern auch für die Bewertung von Arzneimittelmerkmalen wie Adsorption, Verteilung, Stoffwechsel, Ausscheidung und Toxizität (ADMET) für den klinischen Einsatz. Hier stellen wir eine biosensorbasierte Hochdurchsatzstrategie für die Biopannierung von T7-Phagen-angezeigten kurzen Peptiden vor, die leicht auf dem Phagendeckel angezeigt werden können. Eine nachträgliche Analyse der Aminosäuresequenzen von Peptiden, die kurze Segmente enthalten, als “gebrochene Relikte”, der arzneimittelbindenden Stellen mit Bioinformatik-Programmen in der Rezeptligaand-Kontakt-Suite (RELIC) gezeigt. Durch die Anwendung dieser Methode auf zwei klinisch zugelassene Medikamente, einen Anti-Tumor-Irinotecan und ein Anti-Grippe-Oseltamivir, wird der detaillierte Prozess zum Sammeln der arzneimittelerkennenden Peptidsequenzen und zur Hervorhebung der wirkstoffbindenden Stellen der Zielproteine in diesem Papier erläutert. Die hier beschriebene Strategie kann für alle kleinen Moleküle von Interesse angewendet werden.
Introduction
Die Identifizierung von medikamentenbindenden Zielen ist ein wesentlicher Bestandteil für die Entwicklung von Medikamenten sowie für das Verständnis der molekularen Mechanismen von Krankheiten. Insbesondere Rezeptor- und Enzymproteine sind die wichtigsten molekularen Ziele bioaktiver kleiner Moleküle1. Obwohl Affinitätserfassung eine etablierte Technik zur Identifizierung der arzneimittelbindenden Proteine2ist, behindern technische Einschränkungen, wie z. B. die geringe Löslichkeit von Proteinen, oft die Validierung von Wirkstoffzielen2. Am wichtigsten ist, dass die immobilisierten kleinen Moleküle den für das Andocken notwendigen Freiheitsgrad verlieren und für die intern lokalisierten Bindungsstellen auf größeren Zielproteinen unzugänglich sein können. Darüber hinaus behindern Proteinfehlfaltung, Unfähigkeit, Kokristallisationsbedingungen zu analysieren, und Einschränkungen aufgrund molekularer Größe häufig die Verwendung von Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz (NMR) und anderen solchen experimentellen Analysen zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Proteinen.
Die Verwendung des T7 Phagen-Display-Biopannings ist eine effiziente Möglichkeit, die Bindungsstelle auf Proteinen für kleine Molekülköder zu bestimmen3. Insbesondere eine vom T7-Phagen angezeigte zufällige Peptidbibliothek, die durch Einsetzen synthetischer DNA in eine Multiklonierungsstelle aufgebaut werden kann, ist wirksam. Im Vergleich zur T7-Phagenbibliothek, die Proteine anzeigt, können die kurzen Peptide ohne physikalische Einschränkungen einfach auf dem T7-Phagenkapsid angezeigt werden, das sterisch mit jedem kleinen Molekül-Medikament in Berührung kommen kann, das auf einer festen Stütze fixiert ist2. Darüber hinaus ermöglicht die Einführung eines Quarz-Kristall-Mikrobilanz-Biosensors (QCM) in die Biopanning-Plattform t7-Phagendisplay die Identifizierung solcher schwachen, aber spezifischen Wechselwirkungen von kurzen Peptiden mit Medikamenten durch Überwachung der Reduzierung der QCM-Frequenz4,5. Der gebundene T7-Phagen wird dann direkt durch Infizierung des Wirts Escherichia coli (BLT5615) wiederhergestellt, und die DNA-Sequenz der Region, die das affinitätsausgewählte Peptid kodiert, das drogenerkennende Kurzsegmente beherbergt, wird bestimmt. Die nachfolgende Analyse der Aminosäuresequenz der Peptidpopulation liefert Informationen zur Arzneimittelerkennung. In silico paarweise Ausrichtung der geretteten AminosäureSequenzen können verwendet werden, um Informationen über das biologische Ziel des Medikaments innerhalb eines ausgewählten Proteomzuerhaltens zu erhalten. Diese hohe Durchsatzidentifikation von Proteinfragmenten mit Affinität zu einem Medikament kann verwendet werden, um die drogenbindende Stelle heuristisch zu rekonstruieren, ähnlich wie die Rekonstruktion eines alten Artefakts aus Keramikscherben6. Insbesondere kann dieser einzigartige Ansatz nützlich sein, wenn herkömmliche Proteomik-Ansätze fehlschlagen.
Hier stellen wir eine biosensorbasierte Strategie zur Biopannierung von T7-Phagen-Peptiden und Bioinformatik-Analysen zur Zielvalidierung der kleinen Moleküle vor. Über die technischen Beschränkungen konventioneller Methoden hinaus ermöglicht diese Strategie die Identifizierung von Wirkstoffbindungsstellen auf Zielproteinen für jedes kleine Molekül von Interesse nach dem identischen Protokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wurde eine Strategie für die QCM-Biosensien von arzneimittelerkennenden Peptiden vorgestellt, gefolgt von einer Bioinformatik-Analyse zur Validierung von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen unter Verwendung der identifizierten Peptide. Die Entwicklung der kleinen Molekülderivate zur Immobilisierung auf der Goldelektrode des Biosensors ist ein wichtiger Schritt, da der eingeführte Linker die Bindung und Sammlung des Peptids, das das Medikament erkennt, behindern kann. Um dies zu vermeiden, werden Derivate mit unterschiedlichen Positionen des eingeführtenLinkers 23vorbereitet. Alternativ wird der Sensorchip zur Immobilisierung hydrophober kleiner Moleküle in massenhaftes Wasser in eine 10 cm Petrischale getaucht und eine 20-L-Lösung des kleinen Moleküls (10 mM Lösung in Dimethylsulfoxid) auf die Goldelektrode des Biosensors fallen, um seine Oberfläche zu bedecken, und für 5 min inkubiert. Dies ermöglicht die Retention einer intrinsischen Frequenz von kleinen Molekülen mit unter hundert Hertz, die während der Biopannierung mindestens 10 min gehalten wird. Tatsächlich haben die von Osel-Affinität ausgewählten Peptide mit einer solchen Immobilisierung die Osel-Bindungsstelle in NA deutlich hervorgehoben (Abbildung 3).
Der T7-Phagen, der hier für die Vorbereitung der Peptidbibliothek verwendet wird, ist gentechnisch verändert mit der NNK15 Kassette, die 32 Codons für alle 20 Standard-Aminosäuren kodiert und die Entstehung von 2 Stop-Codons (UAA, UGA) unterdrückt und nur UAG (Abbildung 1)6,7. Dies ist wichtig für die Anzeige von 15-mer-Peptiden in voller Länge und die Erhöhung der Vielfalt der Bibliothek. Das Phagenanzeigesystem T7 hat eine technische Anzeigegrenze von 107—109 T7 Phagen. Die Vielfalt der 15-mer-Peptidbibliothek beträgt jedoch theoretisch 2015 (3,27 × 1019); daher kann es nicht für den kompletten Bibliotheksbau verwendet werden. Dennoch ermöglicht die Ähnlichkeitssuche oder der Abbau konservierter Motive den Nachweis der Aminosäuren, die die wirkstoffbindenden Stellen von Proteinen umfassen, auch bei dieser begrenzten Vielfalt an Peptiden in der Bibliothek. Darüber hinaus sind 3-5 Aminosäure-Dehnungen innerhalb des Bibliothekspeptids (die Erscheinungsrate liegt zwischen 1/203 und 1/ 205, die mit dem T7-Phagenanzeigesystem realisiert werden kann) an der Erkennung kleiner Molekülmedikamente beteiligt; Daher ist eine 100%ige Übereinstimmung der Peptidsequenzen mit 15-mer-Aminosäuresequenzen, die die Wirkstoffbindungsstelle des Zielproteins bilden, nicht erforderlich. Tatsächlich haben etwa 30 affinitätsausgewählte Peptide erfolgreich die Bindungsstelle des Zielproteins für jedes getestete Medikament hervorgehoben (Abbildung 4). So kann die Vielfalt der verwendeten Elternbibliothek T7 (1,7 × 107 pfu/ml) genutzt werden, um die drogenbindende Stelle heuristisch zu rekonstruieren.
Typischerweise entstanden innerhalb der 16 Plaques willkürlich isolierte Kopien von T7-Phagen, die die gleichen Sequenzen wie die der 15-mer-Aminosäuresequenzen zeigten, die drogenerkennende Aminosäure-Strecken beherbergen. Dies deutet darauf hin, dass 18-30 verschiedene medikamentös erkennende Peptidsequenzen innerhalb der 96 Plaques isoliert werden (die Zahl ist mit dem Mikroplattenformat verbunden), die anschließend mittels Sequenzierung der DNA und der entsprechenden Aminosäuresequenz identifiziert werden. Nach der vorliegenden Strategie eignet sich die Injektion von 8 l der T7-Phagenbibliothek in die Küvette mit 8 ml Puffer (1000-fache Verdünnung der Bibliothek) zur Reduzierung der unspezifischen Bindung von T7-Phagen. Um die Vielfalt der affinitätsausgewählten Peptide zu erhöhen, erwies sich die mehrfache Wiederholung der Ein-Zyklus-Auswahl und die Verwendung von 16 oder 32 Plaqueisolationen pro Screening als effektiver als die Isolierung von einer einzigen Lösung zu einem Zeitpunkt. Um beispielsweise etwa 30 unterschiedlich sequenzierte, affinitätsausgewählte Peptide effektiv zu sammeln, wurden 3–6 Sätze von Ein-Zyklus-Auswahl durchgeführt, 16 oder 32 Plaques wurden in jedem Experiment isoliert. Das Auftreten identischer Sequenzen in allen 16 oder 32 T7 Phagen-Plaques ist auf eine versehentliche Erkennung des Hintergrunds oder eine Kontamination als Übertragung hindeutet. Im Gegensatz dazu deutet das Fehlen von T7-Phagen mit der gleichen Reihenfolge oder Erscheinung vieler T7-Phagen mit kürzeren Peptiden als die 15-mer-Länge darauf hin, dass T7-Phagen in der Population nicht spezifisch mit hoher Wahrscheinlichkeit entstanden sind. Da die QCM-Frequenzreduktion auch in solchen Fällen im gleichen Ausmaß erfolgt, sollte der Erfolg der Selektion umfassend bewertet werden, indem die DNA des isolierten T7-Phagens sequenziert wird, gefolgt von einer bioinformatischen Analyse der Aminosäuresequenzen der Peptide. Darüber hinaus sind im Gegensatz zum herkömmlichen T7-Phagenanzeigeprotokoll wiederholte Selektionsrunden weniger effektiv, da die Variation und Anzahl der T7-Phagen klein sind und auch nach Wiederholung der Verstärkungs- und Selektionsschritte23nicht konzentriert sind.
Wichtig ist, dass diese Methode für den Abbau kleiner Molekül-bindender Stellen in den Proteomen von Menschen, pathogenen Viren und sogar Pflanzen anwendbar ist. Interessanterweise kann die möglicherweise unstrukturierte kurze Anzeigelänge von Peptiden auf dem T7-Phagenkapsid die molekulare Dynamik von Peptiden von Proteinen während des Andockens mit einem kleinen Molekül imitieren; dies kann die dynamische Bindung24widerspiegeln. Über die technischen Grenzen konventioneller Methoden hinaus kann diese Strategie, die auf identische Protokolle für kleine Moleküle anwendbar ist, das medikamentöse Proteom erweitern und eine größere Granularität in Bezug auf die Wirkstoff-Protein-Interaktionsanalyse bieten.
Bestimmte technische Einschränkungen dieses Ansatzes sollten in Betracht gezogen werden. Die organische Synthese ist für die kleine Molekülimmobilisierung auf der Goldelektrodenoberfläche des Biosensorchips notwendig. Für die Nicht-Experten in der organischen Chemie sind einige Immobilisierungsreagenzien kommerziell erhältlich, um das kleine Molekül durch Kopplung mechanisch zu fixieren. Darüber hinaus können bestimmte Unsinnsanteile der Peptide dazu führen, dass ein Teil des Proteins, der für das Drogendocken nicht relevant ist, als falsch positive Werte nachweisbar ist. Dies entspricht empirisch Beta-Blatt- oder Leucin-reichen Domänen reich an Leucin- oder Valin-Rückständen, die bei der Herstellung von Kopien des T7-Phagens durch mehr Codons als andere Standard-Aminosäuren kodiert werden. Die Steuerung der Bibliothekspeptidlänge kann das Auftreten falschpositiver Positivmeldungen steuern. Im Gegensatz dazu kann es Fälle geben, in denen Aminosäurerückstände an der Wirkstoffbindungsstelle, die am Andocken beteiligt sind, wie mit Röntgenkristallographie oder NMR-Analyse nachgewiesen, nicht nachgewiesen werden. Dies kann gelöst werden, indem eine größere Anzahl der arzneimittelerkennenden Peptide gesammelt oder die Richtung der Fixierung der kleinen Moleküle auf der Goldelektrode geändert wird.
Viele Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen, die mit den Haupt- und Sekundärwirkungen des Drogenkonsums zusammenhängen, können im Proteom noch nicht identifiziert werden; Außerdem könnten Enzyme und Transporter, die für die Wirkstoffaufnahme, -verteilung, -stoffwechsel, -ausscheidung und -toxizität verantwortlich sind, ebenfalls noch nicht identifiziert werden. Proteinbindung ist nicht immer verantwortlich für die Bioaktivität eines Arzneimittels. So wird eine Kombination anderer Informationen aus biologischen Assays die Identifizierung wesentlicher Arzneimittelziele verbessern, die für die wichtigsten und nachteiligen Auswirkungen von Arzneimitteln verantwortlich sind. Weitere Anpassungen dieser prägnanten Technik werden die Praktikabilität und den Durchsatz für den Abbau der Proteinbindungsstellen einer breiten Palette kleiner Molekülmedikamente erhöhen. Die hier vorgestellte Methode wird weitgehend dazu beitragen, nicht nur Grundlagenforschungen in den verwandten Bereichen durchzuführen, sondern auch die molekularen Mechanismen zu klären, die der therapeutischen Wirksamkeit oder anderen biologischen Wirkungen von Arzneimitteln im klinischen Einsatz zugrunde liegen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor dankt Drs. Yujiro Hayashi und Hayato Ishikawa für die Bereitstellung von Oseltamivir und Dr. Lee Makowski für die Bereitstellung der eigenständigen RELIC-Programme. Der Autor würdigt auch Tetsuya Kawagoe für die technische Unterstützung des QCM-Experiments. Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.) unterstützt.
DATENVERFÜGBARKEITS-ANWEISUNG
Die eigenständigen RELIC-Programme und die Sequenzdaten von affinitätsausgewählten Peptiden für Medikamente sowie die in dieser Arbeit verwendeten Proteinsequenzen aus der Proteom-Datenbank sind bei diesem Autor auf Anfrage erhältlich (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).
Materials
| AFFINIXQN | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCM2008-STKIT | Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC |
| AADIV | Northeastern University (Lee Makowski) |
AADIV.exe | Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library. |
| Ceramic Sensor Chip | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMST27C | 4 sensor chips/package |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
D8418 | |
| Ethanol | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 09-0850 | |
| FASTAcon | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAcon.exe | Identifies proteins from a population with short consensus sequences. |
| FASTAskan | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAskan.exe | Lists proteins with high similarity to a peptide population. |
| Immiblization kit for AFFINIX | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMIMKT | SAM reagent and amine coupling reagent |
| INFO | Northeastern University (Lee Makowski) |
INFO.exe | Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule). |
| Liguid LB medium | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
L3522 | Autoclave for 20 min |
| MATCH | Northeastern University (Lee Makowski) |
MATCH.exe | Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length). |
| MOTIF1 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF1.exe | Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population. |
| MOTIF2 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF2.exe | Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths. |
| NaCl | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | S3014 | |
| Recptor ligand contacts (RELIC) | Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA) |
https://www.relic.anl.gov | Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request) |
| Tris | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 252859 |
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