Stratégie d'analyse biopanning et bioinformatique à haut débit basée sur biocapteur pour la validation globale des interactions médicament-protéines
Summary
Cette étude visait à présenter une stratégie pour identifier les interactions médicament-peptide. La stratégie consiste à biopanner les peptides courts reconnaissant les médicaments à partir d’un biocapteur de microbalance quartz-cristal (QCM), suivi d’une analyse bioinformatique pour évaluer quantitativement les informations obtenues pour la reconnaissance et l’annotation des sites de liaison médicamenteux sur les protéines.
Abstract
Les récepteurs et les protéines enzymatiques sont d’importantes biomolécules qui agissent comme cibles contraignantes pour les petites molécules bioactives. Ainsi, la validation rapide et globale des interactions médicament-protéine est hautement souhaitable non seulement pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’efficacité thérapeutique, mais aussi pour évaluer les caractéristiques des médicaments, telles que l’adsorption, la distribution, le métabolisme, l’excrétion et la toxicité (ADMET) à des fins cliniques. Ici, nous présentons une stratégie de débit élevé basée sur le biocapteur pour le biopannage des peptides courts t7 phage-affichés qui peuvent être facilement affichés sur le capside de phage. L’analyse ultérieure des séquences d’acides aminés des peptides contenant de courts segments, comme « reliques brisées », des sites de liaison médicamenteux utilisant des programmes de bioinformatique dans la suite de contact ligand récepteur (RELIC), est également montrée. En appliquant cette méthode à deux médicaments cliniquement approuvés, un irinotecan anti-tumoral et un oseltamivir antigri grippe, le processus détaillé de collecte des séquences peptidiques reconnaissant les médicaments et mettant en évidence les sites de liaison médicamenteuse des protéines cibles sont expliqués dans cet article. La stratégie décrite ci-après peut être appliquée à toutes les petites molécules d’intérêt.
Introduction
L’identification de cibles contraignantes pour les médicaments est essentielle au développement de médicaments ainsi qu’à la compréhension des mécanismes moléculaires des maladies. En particulier, les protéines réceptifs et enzymatiques sont les cibles moléculaires les plus importantes des petites moléculesbioactives 1. Bien que la capture par affinité soit une technique bien établie pour identifier les protéines2qui lier les médicaments, les limitations techniques, telles que la faible solubilité des protéines, entravent souvent la validation des ciblesmédicamentées 2. Plus important encore, les petites molécules immobilisées perdent le degré de liberté nécessaire à l’amarrage et peuvent être inaccessibles aux sites de liaison situés à l’intérieur de l’intérieur sur de plus grandes protéines cibles. En outre, le mauvais déroulement des protéines, l’incapacité d’analyser les conditions de co-cristallisation et les limitations dues à la taille moléculaire entravent souvent l’utilisation de la cristallographie aux rayons X, de la résonance magnétique nucléaire (RM) et d’autres analyses expérimentales de ce genre pour l’étude des interactions médicament-protéine.
L’utilisation du biopannage d’affichage des phages T7 est un moyen efficace de déterminer le site de liaison sur les protéines pour les appâts à petites molécules3. En particulier, une bibliothèque de peptides aléatoires à écran phage T7, qui peut être construite en insérant de l’ADN synthétique dans un site multi-clonage, est efficace. Par rapport à la bibliothèque de phages T7 présentant des protéines, les peptides courts peuvent être facilement conçus pour être affichés sur le capside de phage T7 sans restrictions physiques, qui peut stérilisément entrer en contact avec n’importe quel médicament de petite molécule fixé sur un support solide2. En outre, l’introduction d’un biocapteur de microbalance de quartz-cristal (QCM) dans la plate-forme de biopanning d’affichage de phage de T7 permet l’identification de telles interactions faibles mais spécifiques des peptides courts avec des drogues en surveillant la réduction de la fréquence de QCM4,5. Le phage T7 lié est ensuite directement récupéré en infectant l’hôte Escherichia coli (BLT5615), et la séquence d’ADN de la région qui code le peptide sélectionné par affinité abritant des segments courts reconnaissant la drogue est déterminée. L’analyse suivante de la séquence d’acide aminé de la population de peptide fournit l’information concernant la reconnaissance de drogue. Dans l’alignement silico pairwise des séquences d’acides aminés sauvés peuvent être utilisés pour obtenir des informations concernant la cible biologique du médicament dans un protéome sélectionné. Cette identification à haut débit de fragments de protéines ayant une affinité avec un médicament peut être utilisée pour reconstruire heuristiquement le site de liaison médicamenteuse d’une manière similaire à celle de la reconstruction d’un artefact ancien à partir d’éclats depoterie 6. En particulier, cette approche unique peut être utile lorsque les approches protéomiques conventionnelles échouent.
Ici, nous présentons une stratégie basée sur le biocapteur pour le biopannage des peptides et de l’analyse bioinformatique s’affichant sur les phages T7 pour la validation cible des petites molécules. Au-delà des limitations techniques des méthodes conventionnelles, cette stratégie permet d’identifier des sites de liaison médicamentaire sur les protéines cibles pour toute petite molécule d’intérêt dans le cadre du protocole identique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, une stratégie pour le biopannage basé sur le biocapteur de QCM des peptides médicamenteux-reconnaissants, suivie de l’analyse bioinformatique pour valider des interactions médicament-protéine utilisant les peptides identifiés, a été présentée. La conception des dérivés de petites molécules pour l’immobilisation sur l’électrode d’or du biocapteur est une étape importante, car le linker introduit peut entraver la liaison et la collecte du peptide qui reconnaît le médicament. Pour éviter cela, des dérivés avec différentes positions du linker introduit sont préparés23. Alternativement, pour immobiliser les petites molécules hydrophobes, la puce du capteur est immergée dans l’eau en vrac dans une boîte de Pétri de 10 cm, et une solution de 20 μL de la petite molécule (solution de 10 mM en sulfure de diméthyle) est déposée sur l’électrode d’or du biocapteur, pour couvrir sa surface, et incubée pendant 5 min. Cela permet la rétention d’une fréquence intrinsèque de sous-cent hertz de petites molécules, qui est maintenue pendant au moins 10 min pendant le biopannage. En effet, à l’aide d’une telle immobilisation, les peptides sélectionnés par affinité osel ont clairement mis en évidence le site de liaison Osel dans NA (Figure 3).
Le phage T7 utilisé pour la préparation de la bibliothèque peptidique ici est génétiquement modifié à l’aide de la cassette NNK15 qui code 32 codons pour les 20 acides aminés standard et réprime l’émergence de 2 codons stop (UAA, UGA) et n’émerge que uag (figure 1)6,7. Ceci est important pour afficher des peptides pleine longueur de 15 mer et augmenter la diversité de la bibliothèque. Le système d’affichage des phages T7 a une limite d’affichage techniquede 10 7à10 9 phages T7. Toutefois, la diversité de la bibliothèque peptidique de 15 mer est théoriquement de 2015 (3,27 × 1019); par conséquent, il ne peut pas être utilisé pour la construction complète de la bibliothèque. Néanmoins, la recherche de similitudes ou l’extraction de motifs conservés permet la détection des acides aminés comprenant les sites de liaison médicamenteux des protéines, même avec cette diversité limitée de peptides dans la bibliothèque. En outre, 3-5 acides aminés s’étend dans le peptide de bibliothèque (le taux d’apparence est entre 1/203 et 1/ 205, qui peut être réalisé en utilisant le système d’affichage de phage T7) sont impliqués dans la reconnaissance des médicaments de petites molécules ; par conséquent, une correspondance de 100% des séquences peptidiques avec des séquences d’acides aminés de 15 mer constituant le site de liaison médicamenteux de la protéine cible n’est pas nécessaire. En effet, environ 30 peptides sélectionnés par affinité ont mis en évidence avec succès le site de liaison de la protéine cible pour chaque médicament testé (figure 4). Ainsi, la diversité de la bibliothèque de phages T7 parent utilisé (1,7 × 107 pfu/mL) peut être utilisée pour reconstruire heuristiquement le site de liaison médicamenteux.
Typiquement, 3-5 copies des phages de T7 qui ont montré les mêmes séquences que ceux des séquences d’acides aminés de 15-mer hébergeant des tronçons d’acide aminé drogue-reconnaissants ont émergé dans les 16 plaques arbitrairement isolées, indiquant le succès de la sélection d’affinité sous notre protocole. Ceci indique que 18-30 séquences différentes de peptide drogue-reconnaissant sont rassemblées dans les 96 plaques isolées (le nombre est associé au format de microplaque), qui sont identifiées plus tard utilisant le séquençage de l’ADN et obtenant la séquence correspondante d’acide aminé. Dans la stratégie actuelle, l’injection de 8 μL de la bibliothèque de phages T7 dans la cuvette contenant un tampon de 8 mL (dilution 1000 fois de la bibliothèque) est appropriée pour réduire la liaison non spécifique des phages T7. Pour augmenter la diversité des peptides sélectionnés par affinité, répéter plusieurs fois la sélection d’un cycle et utiliser 16 ou 32 isolements de plaque par criblage s’est avéré plus efficace que l’isolement d’une solution unique à la fois. Par exemple, pour recueillir efficacement environ 30 peptides choisis par affinité différemment, 3 à 6 séries de sélection d’un cycle ont été effectuées, 16 ou 32 plaques ont été isolées dans chaque expérience. L’apparition de séquences identiques dans les 16 ou 32 plaques de phage T7 est indiquée détection accidentelle de fond ou pourrait être contaminée comme report. En revanche, l’absence de phages T7 avec la même séquence ou l’apparence de nombreux phages T7 avec des peptides plus courts que la longueur de 15 mer indique que les phages T7 dans la population non spécifiquement émergé avec une forte probabilité. Comme la réduction de fréquence qcm se produit dans la même mesure même dans de tels cas, le succès de la sélection devrait être complètement évalué en séquençant l’ADN du phage isolé de T7, suivi de l’analyse bioinformatique des séquences d’acide aminé des peptides. En outre, contrairement au protocole conventionnel d’affichage des phages T7, répéter les tours de sélection est moins efficace, car la variation et le nombre des phages T7 sont faibles et ne sont pas concentrés même après avoir répété les étapes d’amplification et desélection 23.
Fait important, cette méthode s’applique à l’extraction de petits sites liant des molécules dans les protéomes des humains, des virus pathogènes et même des plantes. Fait intéressant, la courte longueur d’affichage éventuellement non structurée des peptides sur le capside de phage T7 peut imiter la dynamique moléculaire des peptides des protéines pendant l’amarrage avec une petite molécule ; cela peut refléter la liaison dynamique24. Au-delà des limites techniques des méthodes conventionnelles, cette stratégie, applicable à des protocoles identiques pour les petites molécules, peut étendre le protéome pharmacologique ainsi que fournir plus de granularité en ce qui concerne l’analyse de l’interaction médicament-protéine.
Certaines limites techniques de cette approche devraient être prises en considération. La synthèse organique est nécessaire pour l’immobilisation de petites molécules à la surface de l’électrode d’or de la puce du biocapteur. Pour les non-experts en chimie organique, certains reagents d’immobilisation sont disponibles dans le commerce pour fixer mécaniquement la petite molécule par couplage. En outre, certaines parties absurdes des peptides pourraient entraîner la détection d’une partie de la protéine non pertinente pour l’amarrage des médicaments comme faux positifs. Cela correspond empiriquement aux domaines riches en feuilles bêta ou en leucine riches en leucine ou en résidus de valine, qui sont codés par plus de codons que d’autres acides aminés standard, lorsque des copies du phage T7 sont produites. Le contrôle de la longueur du peptide de la bibliothèque peut contrôler l’apparition de faux positifs. En revanche, il peut y avoir des cas où des résidus d’acides aminés dans le site de liaison médicamentnelle qui sont impliqués dans l’amarrage, comme démontré à l’aide de la cristallographie aux rayons X ou de l’analyse de la NM, ne sont pas détectés. Ceci peut être résolu en recueillant un plus grand nombre de peptides médicamenteux ou en changeant la direction de fixation des petites molécules sur l’électrode d’or.
De nombreuses interactions médicament-protéine qui sont liées aux effets principaux et secondaires de la consommation de drogues peuvent encore ne pas être identifiées dans le protéome; en outre, les enzymes et les transporteurs responsables de l’absorption, de la distribution, du métabolisme, de l’excrétion et de la toxicité des médicaments pourraient également ne pas être identifiés. La liaison protéique n’est pas toujours responsable de la bioactivité d’un médicament. Ainsi, une combinaison d’autres informations provenant d’analyses biologiques améliorera l’identification des cibles essentielles des médicaments responsables des effets principaux et indésirables des médicaments. D’autres adaptations de cette technique concise augmenteront la praticité et le débit pour l’exploitation minière des sites de liaison protéique d’un large éventail de médicaments à petites molécules. La méthode présentée ci-après contribuera en grande partie non seulement à mener des recherches fondamentales dans les domaines connexes, mais aussi à clarifier les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’efficacité thérapeutique ou à d’autres effets biologiques des médicaments utilisés en clinique.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’auteur remercie les Drs Yujiro Hayashi et Hayato Ishikawa d’avoir fourni de l’oseltamivir, et le Dr Lee Makowski d’avoir fourni les programmes autonomes RELIC. L’auteur reconnaît également Tetsuya Kawagoe pour l’assistance technique de l’expérience QCM. Ce travail a été partiellement soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number 17K01363 (Y.T.).
ÉNONCÉ DE DISPONIBILITÉ DES DONNÉES
Les programmes RELIC autonomes et les données de séquence des peptides sélectionnés par affinité pour les médicaments ainsi que les séquences protéiques de la base de données protéome utilisées dans cet article sont disponibles auprès de cet auteur sur demande (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).
Materials
| AFFINIXQN | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCM2008-STKIT | Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC |
| AADIV | Northeastern University (Lee Makowski) |
AADIV.exe | Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library. |
| Ceramic Sensor Chip | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMST27C | 4 sensor chips/package |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
D8418 | |
| Ethanol | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 09-0850 | |
| FASTAcon | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAcon.exe | Identifies proteins from a population with short consensus sequences. |
| FASTAskan | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAskan.exe | Lists proteins with high similarity to a peptide population. |
| Immiblization kit for AFFINIX | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMIMKT | SAM reagent and amine coupling reagent |
| INFO | Northeastern University (Lee Makowski) |
INFO.exe | Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule). |
| Liguid LB medium | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
L3522 | Autoclave for 20 min |
| MATCH | Northeastern University (Lee Makowski) |
MATCH.exe | Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length). |
| MOTIF1 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF1.exe | Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population. |
| MOTIF2 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF2.exe | Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths. |
| NaCl | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | S3014 | |
| Recptor ligand contacts (RELIC) | Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA) |
https://www.relic.anl.gov | Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request) |
| Tris | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 252859 |
References
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack. Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Piggott, A. M., Karuso, P. Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display. Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule. Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).
- Takakusagi, Y., et al. Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display. ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).
- Novagen. T7 Select® System Manual. Novagen. , (2009).
- Novagen. OrientExpressTM cDNA Manual. Novagen. , (2009).
- Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. RELIC–a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites. Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).
- Makowski, L., Petrenko, V. A., Smith, G. P. . Phage Nanobiotechnology. , 33-54 (2011).
- Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins. Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).
- Harel, M., et al. The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action. Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).
- Dodds, H. M., Rivory, L. P. The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11). Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).
- Bencharit, S., et al. Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases. Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).
- Kim, C. U., et al. Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity. Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).
- Hoffmann, G., et al. Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).
- Wishart, D. S., et al. DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018. Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).
- Takakusagi, K., et al. Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).
- Takakusagi, Y., et al. Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).
- Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device. World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).
- Kusayanagi, T., et al. The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).
- Takakusagi, Y., et al. Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).
- Rodi, D. J., et al. Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).
