Biopanning المعالجة البيولوجية القائمة على الاستشعار الحيوي واستراتيجية تحليل المعلوماتية الحيوية للتحقق العالمي من التفاعلات البروتين المخدرات
Summary
هدفت هذه الدراسة إلى تقديم استراتيجية لتحديد التفاعلات الببتيد المخدرات. وتنطوي الاستراتيجية على التحريك الأحيائي للببتيدات القصيرة التي تعترف بالمخدرات استنادا إلى جهاز استشعار دقيق للكوارتز والكريستال ، يليها تحليل المعلوماتية الحيوية لإجراء تقييم كمي للمعلومات التي تم الحصول عليها للتعرف على المخدرات وشرح مواقع ربط المخدرات بالبروتينات.
Abstract
المستقبلات والبروتينات الانزيمات هي الجزيئات الحيوية الهامة التي تعمل كأهداف ملزمة للجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا. وهكذا، فإن التحقق السريع والعالمي من التفاعلات الدوائية البروتينية مرغوب فيه للغاية ليس فقط لفهم الآليات الجزيئية الكامنة في الفعالية العلاجية ولكن أيضا لتقييم خصائص الدواء، مثل الامتزاز، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، والإفراز، والسمية (ADMET) للاستخدام السريري. هنا، نقدم استراتيجية إنتاجية عالية القائمة على الاستشعار الحيوي ل biopanning من الببتيدات القصيرة عرض T7 phage التي يمكن عرضها بسهولة على capsid phage. كما يظهر التحليل اللاحق لمتواليات الأحماض الأمينية للببتيدات التي تحتوي على أجزاء قصيرة ، كـ “آثار مكسورة” لمواقع الربط بالعقاقير باستخدام برامج المعلوماتية الحيوية في مجموعة الاتصال المستقبلة (RELIC). من خلال تطبيق هذه الطريقة على اثنين من الأدوية المعتمدة سريريا، وirinotecan المضادة للورم، ومكافحة الانفلونزا أوسيلتاميفير، يتم شرح العملية التفصيلية لجمع تسلسل الببتيد الاعتراف بالمخدرات وتسليط الضوء على مواقع ربط المخدرات من البروتينات المستهدفة في هذه الورقة. ويمكن تطبيق الاستراتيجية المذكورة هنا على أي جزيئات صغيرة ذات أهمية.
Introduction
وتحديد الأهداف الملزمة للمخدرات أمر أساسي لتطوير العقاقير وكذلك لفهم الآليات الجزيئية للأمراض. على وجه الخصوص، مستقبلات و إنزيم البروتينات هي أهم الأهداف الجزيئية للجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا1. على الرغم من أن القبض على تقارب هو تقنية راسخة لتحديد البروتينات ملزمة المخدرات2, القيود التقنية, مثل ذوبان منخفض من البروتينات, غالبا ما تعيق التحقق من أهداف المخدرات2. والأهم من ذلك، أن الجزيئات الصغيرة التي شلت الحركة تفقد درجة الحرية اللازمة للرسو وقد يتعذر الوصول إليها من مواقع الربط الموجودة داخلياً على بروتينات مستهدفة أكبر. وعلاوة على ذلك، فإن التكبيل بالبروتين وعدم القدرة على تحليل ظروف التبلور المشترك والقيود الناجمة عن الحجم الجزيئي غالباً ما تعوق استخدام التصوير البلوري بالأشعة السينية، والرنين المغناطيسي النووي (NMR)، وغيرها من التحليلات التجريبية لدراسة تفاعلات البروتينات الدوائية.
استخدام عرض phage T7 هو وسيلة فعالة لتحديد موقع ملزم على البروتينات لطعم جزيء صغير3. وعلى وجه الخصوص، فإن مكتبة الببتيد العشوائية المعروضة على شكل T7 phage، والتي يمكن بناؤها عن طريق إدخال الحمض النووي الاصطناعي في موقع متعدد الاستنساخ، فعالة. بالمقارنة مع مكتبة T7 phage عرض البروتينات، والببتيدات القصيرة يمكن هندستها بسهولة ليتم عرضها على phage T7 من دون قيود مادية، والتي يمكن أن تتصل بشكل طبيعي مع أي دواء جزيء صغير ثابت على دعم الصلبة2. وعلاوة على ذلك، فإن إدخال الحساسية الدقيقة الكوارتز-الكريستال (QCM) في منصة عرض T7 phage biopanning يسمح بتحديد مثل هذه التفاعلات الضعيفة ولكن محددة من الببتيدات القصيرة مع المخدرات عن طريق رصد الانخفاض في تردد QCM4،5. ثم يتم استرداد phage T7 المنضم مباشرة عن طريق إصابة القولونية المضيفة Escherichia (BLT5615) ، ويتم تحديد تسلسل الحمض النووي للمنطقة التي يشفر الببتيد المختار الذي يضم شرائح قصيرة معترفة بالمخدرات. التحليل اللاحق لسلسلة الأحماض الأمينية من السكان الببتيد يوفر معلومات بشأن التعرف على المخدرات. في المحاذاة pairwise silico من الأحماض الأمينية التي تم إنقاذها تسلسل يمكن استخدامها للحصول على معلومات بشأن الهدف البيولوجي للدواء داخل البروتيوم مختارة. ويمكن استخدام هذا التحديد عالي الإنتاجية لشظايا البروتين مع تقارب نحو عقار لإعادة بناء موقع ربط المخدرات بشكل أساسي بطريقة مماثلة لتلك التي لإعادة بناء قطعة أثرية قديمة من قطع الفخار6. وعلى وجه الخصوص، يمكن أن يكون هذا النهج الفريد مفيداً عندما تفشل مقاربات البروتيوميات التقليدية.
هنا، نقدم استراتيجية المستندة إلى الاستشعار الحيوي ل biopanning من الببتيدات T7 phage عرض وتحليل المعلوماتية الحيوية للتحقق من صحة الهدف من الجزيئات الصغيرة. وإلى جانب القيود التقنية المفروضة على الطرق التقليدية، تمكن هذه الاستراتيجية من تحديد مواقع ربط المخدرات على البروتينات المستهدفة لأي جزيء صغير ذو أهمية بموجب البروتوكول المماثل.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهنا، تم عرض استراتيجية للانزيم الحيوي القائم على QCM للببتيدات التي تعترف بالمخدرات، تليها تحليل المعلوماتية الحيوية للتحقق من تفاعلات بروتين المخدرات باستخدام الببتيدات المحددة. تصميم مشتقات الجزيء الصغيرة لشل الحركة على القطب الذهبي للحساسية الحيوية هو خطوة هامة، كما قد الرابط المقدمة تعوق الربط وجمع الببتيد الذي يعترف المخدرات. لتجنب هذا ، يتم إعداد المشتقات ذات المواقف المختلفة من الرابط المقدم23. بدلا من ذلك، لشل حركة الجزيئات الصغيرة hydrophobic، يتم غمر رقاقة الاستشعار في الماء السائبة في طبق بيتري 10 سم، ويتم إسقاط حل 20 ميكرولتر من جزيء صغير (10 mM حل في ثنائي الفينيل السلفوكسيد) على القطب الذهبي من جهاز الاستشعار الحيوي، لتغطية سطحه، ومحتضنة لمدة 5 دقائق. وهذا يسمح بالاحتفاظ بتردد هرتز الجوهري من الجزيئات الصغيرة، الذي يتم الاحتفاظ به لمدة 10 دقائق على الأقل أثناء الغسل الحيوي. في الواقع ، باستخدام هذا الجمود ، والببتيدات أوسيل التي تم اختيارها ، أبرزت بوضوح موقع Osel ملزم في NA (الشكل 3).
يتم هندسة phage T7 المستخدمة لإعداد مكتبة الببتيد هنا وراثيا باستخدام الكاسيت NNK15 الذي يقوم بترميز 32 كودون لجميع الأحماض الأمينية القياسية 20 ويقمع ظهور codons وقف 2 (UAA, UGA) ويظهر فقط UAG (الشكل 1)6,7. وهذا أمر مهم لعرض الببتيدات كاملة الطول 15 مر وزيادة تنوع المكتبة. نظام عرض T7 phage لديه حد العرض الفني من 107-109 T7 phages. ومع ذلك, التنوع من ال 15-mer [ببتيد] مكتبة نظريّا 2015 (3.27 × 1019); وهكذا، لا يمكن استخدامه لبناء مكتبة كاملة. ومع ذلك، فإن البحث عن التشابه أو التعدين من الزخارف المحفوظة يسمح الكشف عن الأحماض الأمينية التي تتألف من مواقع ملزمة المخدرات من البروتينات حتى مع هذا التنوع المحدود من الببتيدات في المكتبة. وبالإضافة إلى ذلك، 3-5 تمتد الأحماض الأمينية داخل مكتبة الببتيد (معدل ظهور بين 1/203 و 1/ 205،والتي يمكن أن تتحقق باستخدام نظام عرض T7 phage) وتشارك في التعرف على أدوية جزيء صغير؛ لذلك، لا يلزم تطابق 100٪ من متواليات الببتيد مع تسلسلات الأحماض الأمينية 15-mer التي تشكل موقع الربط الدوائي للبروتين المستهدف. في الواقع، ما يقرب من 30 الببتيدات التي تم اختيارها تقارب بنجاح أبرز موقع الربط من البروتين الهدف لكل دواء اختباره(الشكل 4). وهكذا، فإن تنوع مكتبة Phage الأم T7 المستخدمة (1.7 ×10 7 pfu/mL) يمكن استخدامه لإعادة بناء موقع الربط بالعقاقير بشكل أساسي.
عادة، ظهرت 3-5 نسخ من phages T7 التي عرضت نفس تسلسلات تلك من تسلسل الأحماض الأمينية 15-mer التي تأوي امتدادات الأحماض الأمينية المعترفة بالعقاقير داخل اللويحات الـ 16 المعزولة بشكل تعسفي، مما يشير إلى نجاح اختيار التقارب بموجب بروتوكولنا. وهذا يشير إلى أن 18-30 مختلفة المخدرات التعرف على تسلسل الببتيد يتم جمعها داخل 96 لويحات معزولة (ويرتبط الرقم مع شكل microplate)، والتي يتم تحديدها في وقت لاحق باستخدام تسلسل الحمض النووي والحصول على تسلسل الأحماض الأمينية المقابلة. في الاستراتيجية الحالية ، حقن 8 ميكرولتر من مكتبة T7 phage في cuvette التي تحتوي على 8 مل العازلة (1000 أضعاف تخفيف المكتبة) هو مناسبة للحد من الربط غير محددة من phages T7. لزيادة تنوع الببتيدات المختارة من التقارب، تكرار اختيار دورة واحدة عدة مرات واستخدام 16 أو 32 عزل البلاك لكل فحص ثبت أن تكون أكثر فعالية من العزلة عن حل واحد في وقت واحد. على سبيل المثال، لجمع نحو 30 ببتيدات منتقاة من القرابة بشكل مختلف، تم إجراء 3-6 مجموعات من اختيار دورة واحدة، وتم عزل 16 أو 32 لويحات في كل تجربة. يشار إلى ظهور تسلسلات متطابقة في جميع 16 أو 32 T7 فيج لويحات الكشف عن طريق الخطأ من الخلفية أو قد تلوث كما حمل. في المقابل، فإن غياب phages T7 مع نفس التسلسل أو المظهر للعديد من phages T7 مع الببتيدات أقصر من طول 15 مير يشير إلى أن Phages T7 في السكان غير ظهرت على وجه التحديد مع احتمال كبير. كما يحدث الحد من التردد QCM إلى نفس القدر حتى في مثل هذه الحالات، ينبغي تقييم نجاح الاختيار بشكل شامل من خلال تسلسل الحمض النووي للphage T7 معزولة، تليها تحليل المعلوماتية الحيوية من تسلسل الأحماض الأمينية من الببتيدات. وعلاوة على ذلك، على عكس بروتوكول عرض T7 phage التقليدية، تكرار جولات من اختيار أقل فعالية، كما الاختلاف وعدد من phages T7 صغيرة ولا تتركز حتى بعد تكرار خطوات التضخيم والاختيار23.
الأهم من ذلك، هذه الطريقة قابلة للتطبيق لتعدين مواقع صغيرة لتكبيك الجزيئات في البروتيومات من البشر، الفيروسات المسببة للأمراض، وحتى النباتات. ومن المثير للاهتمام, وربما غير منظم طول العرض القصير من الببتيدات على t7 phage capsid يمكن محاكاة الديناميات الجزيئية للببتيدات من البروتينات أثناء الالتحام مع جزيء صغير; يمكن أن يعكس هذا الربط الديناميكي24. وإلى جانب القيود التقنية للأساليب التقليدية، فإن هذه الاستراتيجية، التي تنطبق على بروتوكولات مماثلة للجزيئات الصغيرة، قد توسع البروتيوم القابلة للتخويد، فضلا عن توفير المزيد من التفاصيل فيما يتعلق بتحليل التفاعل بين المخدرات والبروتين.
وينبغي النظر في بعض القيود التقنية لهذا النهج. التركيب العضوي ضروري لشل جزيء صغير على سطح القطب الذهبي لرقاقة المنادق الحيوي. بالنسبة لغير الخبراء في الكيمياء العضوية ، تتوفر بعض الكواشف المتحركة تجاريًا لإصلاح الجزيء الصغير ميكانيكيًا عن طريق الاقتران. وعلاوة على ذلك, بعض أجزاء هراء من الببتيدات قد يؤدي إلى الكشف عن جزء من البروتين لا علاقة لدواء الالتحام كما ايجابيات كاذبة. وهذا يتوافق تجريبيا إلى بيتا ورقة أو ليوسين الغنية المجالات الغنية في بقايا ليوسين أو فالين، والتي يتم ترميزها من قبل أكثر كودون من غيرها من الأحماض الأمينية القياسية، عندما يتم إنتاج نسخ من phage T7. التحكم في طول ببتيد مكتبة قد تتحكم في حدوث ايجابيات كاذبة. وعلى النقيض من ذلك، قد تكون هناك حالات لا يتم فيها اكتشاف بقايا الأحماض الأمينية في موقع الربط بالعقاقير التي تشارك في الإرساء، كما هو موضح باستخدام التصوير البلوري بالأشعة السينية أو تحليل الـ NMR. ويمكن حل هذا عن طريق جمع عدد أكبر من الببتيدات التعرف على المخدرات أو تغيير اتجاه تحديد جزيئات صغيرة على القطب الذهبي.
العديد من التفاعلات الدوائية البروتينية التي ترتبط بالآثار الرئيسية والثانوية لتعاطي المخدرات قد تكون مجهولة في البروتيوم. بالإضافة إلى ذلك، قد تكون الإنزيمات والناقل المسؤولين عن امتصاص المخدرات، والتوزيع، والتمثيل الغذائي، والإفراز، والسمية، أيضاً غير معروفة. البروتين ملزمة ليست مسؤولة دائما عن النشاط البيولوجي للدواء. وهكذا، فإن الجمع بين المعلومات الأخرى المستقاة من الإحصاءات البيولوجية سيحسن من تحديد الأهداف الأساسية للمخدرات المسؤولة عن الآثار الرئيسية والضارة للمخدرات. وسوف مزيد من التكيف من هذه التقنية موجزة زيادة العملية والإنتاجية للتعدين من مواقع البروتين ملزمة لمجموعة واسعة من الأدوية جزيء صغير. الطريقة المعروضة هنا سوف تسهم إلى حد كبير ليس فقط في إجراء البحوث الأساسية في المجالات ذات الصلة ولكن أيضا توضيح الآليات الجزيئية التي تقوم عليها فعالية علاجية أو غيرها من الآثار البيولوجية للأدوية في الاستخدام السريري.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلف الدكتورين يوجيرو هاياشي وهياتو إيشيكاوا على توفير الأوسيلتاميفير، والدكتور لي ماكوفسكي على توفير برامج RELIC القائمة بذاتها. كما يعترف المؤلف بتيتسويا كاواغوي للمساعدة التقنية التي قُدِّمَت من تجربة QCM. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JSPS KAKENHI منحة رقم 17K01363 (Y.T.).
بيان توفر البيانات
برامج الـ RELIC المستقلة وبيانات تسلسل الببتيدات المختارة للأدوية وكذلك تسلسل البروتين من قاعدة بيانات البروتيوم المستخدمة في هذه الورقة متاحة من هذا المؤلف عند الطلب (tkksg@rs.noda.tus.ac.jp).
Materials
| AFFINIXQN | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCM2008-STKIT | Contains Glass cuvette, stir magnet, operation and analysis software with a Windows PC |
| AADIV | Northeastern University (Lee Makowski) |
AADIV.exe | Calculates the frequency of occurrence of each of the 20 amino acids at each recombinant insert position, as well as the overall position-independent frequency of each amino acid within that set of peptide sequences. Also roughly estimates the sequence diversity of a display library by statistical sampling method based upon sequences obtained from a limited number of randomly sampled members of the library. |
| Ceramic Sensor Chip | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMST27C | 4 sensor chips/package |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
D8418 | |
| Ethanol | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 09-0850 | |
| FASTAcon | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAcon.exe | Identifies proteins from a population with short consensus sequences. |
| FASTAskan | Northeastern University (Lee Makowski) |
FASTAskan.exe | Lists proteins with high similarity to a peptide population. |
| Immiblization kit for AFFINIX | ULVAC, Inc. (Tokyo, Japan) | QCMIMKT | SAM reagent and amine coupling reagent |
| INFO | Northeastern University (Lee Makowski) |
INFO.exe | Provides mathematical measure of the probability of observing a particular peptide sequence by random chance (i.e., nonspecific binding) as opposed to by selection for a specific property (affinity to small molecule). |
| Liguid LB medium | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) |
L3522 | Autoclave for 20 min |
| MATCH | Northeastern University (Lee Makowski) |
MATCH.exe | Identifies any stretches of amino acid residues within a particular protein that exhibit significant similarity to a group of affinity-selected peptides. Outputs as cluster dia- gram and cumulative similarity plot calculated from a modified BLOSUM62 matrix with a short window (5–6 amino acids in length). |
| MOTIF1 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF1.exe | Searches for three continuous amino acid sequence motifs within a peptide population. |
| MOTIF2 | Northeastern University (Lee Makowski) |
MOTIF2.exe | Searches for patterns of three amino acids and does not allow conservative amino acid substitutions, but does allow identical gap lengths. |
| NaCl | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | S3014 | |
| Recptor ligand contacts (RELIC) | Argonne National Laboratory (Lemont, IL, USA) |
https://www.relic.anl.gov | Currently unavailable (Stand-alone program can be used from correspondence author upon request) |
| Tris | Merck (Kenilworth, NJ, USA) | 252859 |
References
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Ziegler, S., Pries, V., Hedberg, C., Waldmann, H. Target identification for small bioactive molecules: finding the needle in the haystack. Angewandte Chemie International Edition (English). 52 (10), 2744-2792 (2013).
- Piggott, A. M., Karuso, P. Identifying the cellular targets of natural products using T7 phage display. Natural Product Reports. 33 (5), 626-636 (2016).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sakaguchi, K., Sugawara, F. Phage display technology for target determination of small-molecule therapeutics: an update. Expert Opinion on Drug Discovery. 15 (10), 1199-1211 (2020).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Use of phage display technology for the determination of the targets for small-molecule therapeutics. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (4), 361-389 (2010).
- Takakusagi, Y., Takakusagi, K., Sugawara, F., Sakaguchi, K. Using the QCM Biosensor-Based T7 Phage Display Combined with Bioinformatics Analysis for Target Identification of Bioactive Small Molecule. Methods in Molecular Biology. 1795, 159-172 (2018).
- Takakusagi, Y., et al. Mapping a disordered portion of the Brz2001-binding site on a plant monooxygenase, DWARF4, using a quartz-crystal microbalance biosensor-based T7 phage display. ASSAY and Drug Devevelopment Technologies. 11 (3), 206-215 (2013).
- Novagen. T7 Select® System Manual. Novagen. , (2009).
- Novagen. OrientExpressTM cDNA Manual. Novagen. , (2009).
- Mandava, S., Makowski, L., Devarapalli, S., Uzubell, J., Rodi, D. J. RELIC–a bioinformatics server for combinatorial peptide analysis and identification of protein-ligand interaction sites. Proteomics. 4 (5), 1439-1460 (2004).
- Makowski, L., Petrenko, V. A., Smith, G. P. . Phage Nanobiotechnology. , 33-54 (2011).
- Garcia-Carbonero, R., Supko, J. G. Current perspectives on the clinical experience, pharmacology, and continued development of the camptothecins. Clinical Cancer Research. 8 (3), 641-661 (2002).
- Harel, M., et al. The crystal structure of the complex of the anticancer prodrug 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]-carbonyloxycamptothecin (CPT-11) with Torpedo californica acetylcholinesterase provides a molecular explanation for its cholinergic action. Molecular Pharmacology. 67 (6), 1874-1881 (2005).
- Dodds, H. M., Rivory, L. P. The mechanism for the inhibition of acetylcholinesterases by irinotecan (CPT-11). Molecular Pharmacology. 56 (6), 1346-1353 (1999).
- Bencharit, S., et al. Structural insights into CPT-11 activation by mammalian carboxylesterases. Nature Structural Biology. 9 (5), 337-342 (2002).
- Kim, C. U., et al. Influenza neuraminidase inhibitors possessing a novel hydrophobic interaction in the enzyme active site: design, synthesis, and structural analysis of carbocyclic sialic acid analogues with potent anti-influenza activity. Journal of the American Chemical Society. 119 (4), 681-690 (1997).
- Hoffmann, G., et al. Nonclinical pharmacokinetics of oseltamivir and oseltamivir carboxylate in the central nervous system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (11), 4753-4761 (2009).
- Wishart, D. S., et al. DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018. Nucleic Acids Research. 46 (1), 1074-1082 (2018).
- Takakusagi, K., et al. Multimodal biopanning of T7 phage-displayed peptides reveals angiomotin as a potential receptor of the anti-angiogenic macrolide Roxithromycin. European Journal of Medicinal Chemistry. 90, 809-821 (2015).
- Takakusagi, Y., et al. Efficient one-cycle affinity selection of binding proteins or peptides specific for a small-molecule using a T7 phage display pool. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (22), 9837-9846 (2008).
- Takakusagi, Y., Suzuki, A., Sugawara, F., Kobayashi, S., Sakaguchi, K. Self-assembled monolayer (SAM) of small organic molecule for efficient random-peptide phage display selection using a cuvette type quartz-crystal micobalance (QCM) device. World Journal of Engineering. 5, 1005-1006 (2009).
- Kusayanagi, T., et al. The antitumor agent doxorubicin binds to Fanconi anemia group F protein. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 20 (21), 6248-6255 (2012).
- Takakusagi, Y., et al. Identification of C10 biotinylated camptothecin (CPT-10-B) binding peptides using T7 phage display screen on a QCM device. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 15 (24), 7590-7598 (2007).
- Rodi, D. J., et al. Identification of small molecule binding sites within proteins using phage display technology. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 4 (7), 553-572 (2001).
