Dissezione e Live-Imaging della Drosophila Gonad embrionale tardiva
Summary
Qui, forniamo un protocollo di dissezione necessario per l’immagine dal vivo della gonade maschio drosophila embrionale tardiva . Questo protocollo consentirà l’osservazione di processi cellulari dinamici in condizioni normali o dopo manipolazione transgenica o farmacologica.
Abstract
La gonade embrionale maschile Drosophila melanogaster è un modello vantaggioso per studiare vari aspetti della biologia dello sviluppo tra cui, ma non solo, lo sviluppo delle cellule germinali, la biologia del piRNA e la formazione di nicchia. Qui, presentiamo una tecnica di dissezione per l’immagine dal vivo della gonade ex vivo durante un periodo in cui l’imaging dal vivo dal vivo è altamente inefficace. Questo protocollo delinea come trasferire gli embrioni in un piatto di imaging, scegliere embrioni maschili opportunamente messi in scena e sezionare la gonade dal tessuto circostante pur mantenendo la sua integrità strutturale. Dopo la dissezione, le gonadi possono essere fotografate utilizzando un microscopio confocale per visualizzare i processi cellulari dinamici. La procedura di dissezione richiede tempi e destrezza precisi, ma forniamo informazioni su come prevenire errori comuni e su come superare queste sfide. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo protocollo di dissezione per la gonade embrionale Drosophila e consentirà l’imaging dal vivo durante una finestra di tempo altrimenti inaccessibile. Questa tecnica può essere combinata con manipolazioni transgeniche farmacologiche o specifiche del tipo cellulare per studiare eventuali processi dinamici che si verificano all’interno o tra le cellule nel loro ambiente gonadico naturale.
Introduction
Il testicolo della Drosophila melanogaster è servito come paradigma per la nostra comprensione di molti processi cellulari dinamici. Gli studi di questo modello hanno fatto luce sulla regolazione della divisione delle cellule staminali 1,2,3, sullo sviluppo delle cellule germinali 4,5, sulla biologia del piRNA 6,7,8 e sugli eventi di segnalazione delle cellule staminali di nicchia 9,10,11,12,13. Questo modello è vantaggioso perché è geneticamente trattabile14,15 ed è uno dei pochi in cui possiamo vivere le cellule staminali nel loro ambiente naturale 3,16,17,18. Tuttavia, l’imaging dal vivo di questo modello è stato limitato al tessuto adulto e ai primi stadi embrionali, lasciando una lacuna nella nostra conoscenza della dinamica gonadica nell’embrione tardivo, lo stadio preciso in cui la nicchia si sta formando per la prima volta e inizia a funzionare.
La gonade embrionale in stadio avanzato è una sfera, costituita da cellule di nicchia somatiche nella parte anteriore e cellule germinali incistate da cellule gonadiche somatiche in più regioni posteriori19. Questo organo può essere ripreso vivo fino allo stadio embrionale precoce 17 17,20,21. Ulteriori immagini sono prevenute a causa dell’inizio di contrazioni muscolari su larga scala. Queste contrazioni sono così gravi che spingono la gonade fuori dal fotogramma di imaging e tale movimento non può essere corretto con un software di imaging. Il nostro laboratorio è interessato a svelare i meccanismi della formazione di nicchia, che si verifica durante questo periodo sfuggente per l’imaging dal vivo. Pertanto, abbiamo generato un approccio ex vivo per l’immagine dal vivo della gonade a partire dallo stadio embrionale 16, facilitando lo studio della dinamica cellulare durante questo periodo cruciale di sviluppo delle gonadi. Precedenti lavori del nostro laboratorio mostrano che questa imaging ex vivo ricapitola fedelmente lo sviluppo delle gonadi in vivo 17. Questa tecnica è la prima e unica del suo genere per la gonade embrionale drosophila.
Qui presentiamo il protocollo di dissezione richiesto per l’imaging live ex vivo della gonade durante le fasi embrionali tardive. Questo protocollo può essere combinato con trattamenti farmacologici o manipolazione transgenica di specifici lignaggi cellulari all’interno della gonade. Usando questa tecnica, abbiamo ripreso con successo le fasi della formazione di nicchia delle cellule staminali17. Questo approccio di imaging è quindi strumentale per il campo della biologia delle cellule staminali, in quanto consentirà la visualizzazione delle fasi iniziali della formazione di nicchia in tempo reale all’interno del suo ambiente naturale15,17. Mentre questo metodo è utile per il campo della biologia delle cellule staminali, è inoltre applicabile per visualizzare eventuali processi dinamici che si verificano nella gonade durante questo punto temporale di sviluppo, compresi i riarrangiamenti cellulari22, l’adesione cellulare 2,12,23 e la migrazione cellulare23. Questo protocollo di dissezione migliorerà così la nostra comprensione di molti processi biologici cellulari fondamentali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la gonadogenesi, la gonade embrionale, e in particolare la nicchia delle cellule staminali all’interno della gonade maschile15, subisce rapidi cambiamenti morfologici. I meccanismi di sviluppo che sono alla base di questi cambiamenti dinamici sono meglio compresi attraverso tecniche di live-imaging. Tuttavia, allo stadio embrionale 17, l’imaging in vivo della gonade è reso impossibile dall’insorgenza di contrazioni muscolari su larga scala17. Con questo pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Lindsey W. Plasschaert e Justin Sui per i loro sostanziali contributi allo sviluppo iniziale di questo protocollo. Gli autori sono grati alla comunità delle mosche per la loro generosità con i reagenti, e in particolare a Ruth Lehmann e Benjamin Lin per il loro dono della linea nos5′-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3′ prima della sua pubblicazione. In questo studio sono state utilizzate le scorte ottenute dal Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Questo lavoro è stato supportato da NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 e R35GM136270 (S.D) e dalle borse di formazione T32GM007229 (B.W.) e F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
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