Dissection et imagerie en direct de la drosophile embryonnaire tardive Gonad
Summary
Ici, nous fournissons un protocole de dissection nécessaire pour représenter en direct la gonade mâle embryonnaire tardive de la drosophile . Ce protocole permettra d’observer des processus cellulaires dynamiques dans des conditions normales ou après manipulation transgénique ou pharmacologique.
Abstract
La gonade embryonnaire mâle Drosophila melanogaster est un modèle avantageux pour étudier divers aspects de la biologie du développement, y compris, mais sans s’y limiter, le développement des cellules germinales, la biologie des piARN et la formation de niches. Ici, nous présentons une technique de dissection pour imager en direct la gonade ex vivo pendant une période où l’imagerie en direct in vivo est très inefficace. Ce protocole décrit comment transférer des embryons dans une boîte d’imagerie, choisir des embryons mâles mis en scène de manière appropriée et disséquer la gonade de ses tissus environnants tout en maintenant son intégrité structurelle. Après dissection, les gonades peuvent être imagées à l’aide d’un microscope confocal pour visualiser les processus cellulaires dynamiques. La procédure de dissection nécessite un timing et une dextérité précis, mais nous fournissons un aperçu de la façon de prévenir les erreurs courantes et de surmonter ces défis. À notre connaissance, il s’agit du premier protocole de dissection pour la gonade embryonnaire de la drosophile et permettra l’imagerie en direct pendant une fenêtre de temps autrement inaccessible. Cette technique peut être combinée avec des manipulations transgéniques pharmacologiques ou spécifiques au type cellulaire pour étudier tout processus dynamique se produisant à l’intérieur ou entre les cellules dans leur environnement gonadique naturel.
Introduction
Le testicule drosophila melanogaster a servi de paradigme pour notre compréhension de nombreux processus cellulaires dynamiques. Les études de ce modèle ont mis en lumière la régulationde la division des cellules souches 1,2,3, le développement des cellules germinales 4,5, la biologie des arnos 6,7,8 et les événements de signalisation des cellules souches de niche 9,10,11,12,13. Ce modèle est avantageux car il est génétiquement traitable14,15 et est l’un des rares où l’on peut imager en direct des cellules souches dans leur environnement naturel 3,16,17,18. Cependant, l’imagerie en direct de ce modèle a été limitée aux tissus adultes et aux premiers stades embryonnaires, laissant une lacune dans notre connaissance de la dynamique gonadique chez l’embryon tardif, le stade précis où la niche se forme et commence à fonctionner.
La gonade embryonnaire à un stade avancé est une sphère, composée de cellules de niche somatiques à l’antérieure et de cellules germinales enkystées par des cellules gonadiques somatiques dans des régions plus postérieures19. Cet organe peut être imagé en direct in vivo jusqu’au stade embryonnaire précoce 17 17,20,21. Une imagerie supplémentaire est empêchée en raison de l’initiation de contractions musculaires à grande échelle. Ces contractions sont si graves qu’elles poussent la gonade hors du cadre d’imagerie, et un tel mouvement ne peut pas être corrigé avec un logiciel d’imagerie. Notre laboratoire s’intéresse au dévoilement des mécanismes de formation de niches, qui se produit pendant cette période insaisissable pour l’imagerie en direct. Par conséquent, nous avons généré une approche ex vivo pour imager en direct la gonade à partir du stade embryonnaire 16, facilitant l’étude de la dynamique cellulaire pendant cette période cruciale du développement des gonades. Des travaux antérieurs de notre laboratoire montrent que cette imagerie ex vivo récapitule fidèlement le développement in vivo des gonades17. Cette technique est la première et la seule du genre pour la gonade embryonnaire de la drosophile.
Nous présentons ici le protocole de dissection requis pour l’imagerie en direct ex vivo de la gonade à la fin du stade embryonnaire. Ce protocole peut être combiné avec des traitements pharmacologiques ou une manipulation transgénique de lignées cellulaires spécifiques dans les gonades. En utilisant cette technique, nous avons photographié avec succès les étapes de la formation de niche de cellules souches17. Cette approche d’imagerie est donc déterminante pour le domaine de la biologie des cellules souches, car elle permettra de visualiser les premières étapes de la formation de niches en temps réel dans son environnement naturel15,17. Bien que cette méthode soit bénéfique pour le domaine de la biologie des cellules souches, elle est également applicable pour visualiser tous les processus dynamiques se produisant dans les gonades au cours de ce point temporel de développement, y compris les réarrangements cellulaires22, l’adhésion cellulaire 2,12,23 et la migration cellulaire23. Ce protocole de dissection améliorera ainsi notre compréhension de nombreux processus biologiques cellulaires fondamentaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Au cours de la gonadogenèse, la gonade embryonnaire, et en particulier la niche de cellules souches dans la gonademâle 15, subit des changements morphologiques rapides. Les mécanismes de développement qui sous-tendent ces changements dynamiques sont mieux compris par des techniques d’imagerie en direct. Cependant, au stade embryonnaire 17, l’imagerie in vivo de la gonade est rendue impossible par l’apparition de contractions musculaires à grande échelle17</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Lindsey W. Plasschaert et Justin Sui pour leurs contributions substantielles à l’élaboration précoce de ce protocole. Les auteurs sont reconnaissants à la communauté des mouches pour leur générosité avec les réactifs, et en particulier à Ruth Lehmann et Benjamin Lin pour leur don de la ligne nos5′-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3′ avant sa publication. Les stocks obtenus du Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537) ont été utilisés dans cette étude. Ce travail a été soutenu par NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 et R35GM136270 (S.D) ainsi que par des bourses de formation T32GM007229 (B.W.) et F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
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