Un test di citometria a flusso basato su DNA / Ki67 per l'analisi del ciclo cellulare di cellule T CD8 antigene-specifiche in topi vaccinati

I topi sono stati ospitati presso la Plaisant Animal Facility e il lavoro è stato eseguito con il numero di autorizzazione del Ministero della Salute italiano 1065/2015-PR. Il protocollo ha seguito le linee guida per la cura degli animali secondo le leggi e le politiche nazionali e internazionali (Direttiva UE 2010/63/UE; D.Lgs. 26/2014). 1. Preparazione del mezzo e della soluzione colorante Preparare il mezzo completo: roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio con 2 mM di glutammina, 100 U / mL di penicillina / streptomicina, 50 μM di beta-mercaptoetanolo e 10% di volume / volume (v / v) di siero bovino fetale (FBS) Preparare il tampone colorante: soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca2+/ Mg2 + (PBS) con 1% peso / volume (p / v) albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM di sale disodico dell’acido etilendidatetraacetico (EDTA) 2. Trattamento con topo Topi Balb/c femmina di 7-8 settimane mediante iniezione intramuscolare (i.m.) nei quadricipiti del virus dell’immunodeficienza umana (HIV)-1-gag-expressing-scimpanzé vettore adenovirale (ChAd3-gag) con una dose di 107 particelle virali. A 1-4 mesi dopo l’innesco, aumentare una volta i topi con i.m. iniezione di VIRUS Ankara vaccinia modificato che esprime HIV-1-gag (MVA-gag) con una dose di 106 unità di formazione della placca. Al giorno 3 post-boost, sacrifica i topi potenziati dalla lussazione cervicale e analizzali in parallelo con i topi non trattati. Raccogli i LNs drenando i quadricipiti (iliaci, poplitei e inguinali) e la milza da topi potenziati e non trattati. Inoltre, raccogliere il BM dalle due zampe posteriori da topi non trattati e utilizzare questo BM per le impostazioni del citometro a flusso e come controllo positivo per l’analisi del ciclo cellulare (Figura 2).NOTA: genera vettori ChAd3-gag e MVA-gag come descritto in precedenza12,15,16,17. 3. Isolamento delle cellule LN, milza e BM drenanti Isolamento delle cellule della milza e LN Posizionare 5 mL di mezzo completo in ciascuno dei due tubi da 15 mL e tenerli sul ghiaccio, pronti per la raccolta degli organi. Sacrificare un topo adulto per lussazione cervicale. Posizionare il mouse sul dorso e sterilizzare la superficie della pelle con etanolo al 70% v/v. Per raccogliere gli LN inguinali, fare un’incisione longitudinale di ~ 1 cm sull’addome con le forbici e allungare l’incisione con la pinza. Visualizza gli LN inguinali sulla superficie interna della pelle e raccoglili con la pinza. Posizionare gli LN inguinali in uno dei due tubi da 15 mL preparati al punto 3.1.1. Per raccogliere la milza, fare un’incisione peritoneale con le forbici e rimuovere la milza. Dopo aver tagliato il tessuto connettivo circostante, posizionare la milza nel secondo tubo da 15 ml preparato al punto 3.1.1. Per raccogliere gli LN iliaci, sposta le viscere da parte e visualizza i LN iliaci vicino alla vena cava inferiore, quindi raccoglili usando la pinza. Posizionare gli LN iliaci nello stesso tubo contenente gli LN inguinali.NOTA: Per ottenere un numero sufficiente di cellule LN per la colorazione (vedere paragrafo 4), è spesso necessario raggruppare IN poplitea, inguinali e iliaci da un topo. Questi LN drenano tutti i quadricipiti (il sito di i.m. vaccinazione). Questo protocollo utilizza un solo tubo da 15 ml di LN in pool. Per raccogliere LN poplitei, afferrare la pelle delle zampe posteriori e tirarla delicatamente verso il basso per scoprire i muscoli. Quindi, inserire la pinza tra i muscoli sotto l’articolazione del ginocchio e raccogliere i LN poplitei. Posizionare i LN poplitei nello stesso tubo contenente LN inguinali e iliaci.NOTA: vedere la nota dopo il 3.1.7. Posizionare la milza in un filtro cellulare da 70 μm all’interno di una capsula di coltura da 60 mm riempita con 5 mL di terreno completo. Utilizzando uno stantuffo a siringa da 5 ml, schiacciare delicatamente l’organo fino alla sua completa disaggregazione. Rimuovere il filtro e trasferire la sospensione cellulare in un tubo pulito da 15 ml. Aggiungere 5 ml di terreno completo al piatto di coltura e lavare accuratamente il piatto e il colino per assicurarsi che tutte le cellule siano state recuperate. Piscina con il resto della sospensione della cellula della milza nel tubo da 15 ml. Per i LN inguinali, iliaci e popliteali raggruppati, preparare una sospensione a singola cellula seguendo una procedura simile a quella utilizzata nei passaggi da 3.1.9 a 3.1.11 per la milza. Centrifugare celle a 400 × g per 10 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare i pellet cellulari in PBS. Contare le cellule con una camera Neubauer utilizzando il tampone di lisi dei globuli rossi e lo 0,04% v/v di tripano blu in PBS. Isolamento delle cellule BM Posizionare 5 mL di mezzo completo in un tubo da 15 ml e tenerlo sul ghiaccio, pronto per la raccolta delle zampe posteriori. Sacrificare un topo adulto per lussazione cervicale. Sterilizzare la superficie della pelle con etanolo al 70% v/v. Fai un’incisione trasversale di ~ 1 cm sulla pelle ventrale con le forbici, afferra saldamente la pelle su entrambi i lati del taglio e tira delicatamente verso il basso per scoprire i muscoli delle zampe posteriori. Per eliminare la pelle dalla parte posteriore delle zampe posteriori, mantenendo il mouse in posizione supina, posizionare il morsetto sotto il ginocchio e tirare verso l’alto per esporre i muscoli. Tagliare le ossa alle due estremità di una zampa posteriore: l’articolazione pelvica / anca e la caviglia. Trasferire entrambe le zampe posteriori sul tubo da 15 mL preparato al punto 3.2.1. Tenere il tubo sul ghiaccio. Prendi le zampe posteriori dal tubo da 15 ml e trasferiscile su carta velina. Tagliare le zampe posteriori appena sotto l’articolazione del ginocchio per rimuovere la tibia. Sezionare il femore e la tibia dai muscoli circostanti, rimuovere il tessuto in eccesso usando le forbici e bagnare la carta velina. Tagliare le estremità dell’osso con le forbici per esporre l’albero del midollo interno. Inserire la tibia e il femore nel tubo di estrazione BM (vedere preparazione in 3.2.9.1-3.2.9.218), con l’estremità più larga nella parte inferiore. Tagliare una punta della pipetta da 200 μL sulla linea appena sopra l’estremità della punta e sulla linea da 100 μL. Posizionare la parte centrale nella sezione superiore e più grande della punta e posizionarla in un tubo di microfuga da 1,5 ml. Ruotare il tubo di estrazione BM a 800 × g per 1 min. Scartare l’osso e risospescire vigorosamente il pellet in 1 mL di mezzo completo per rimuovere eventuali grappoli. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro da 70 μm posto sulla parte superiore di un tubo da 15 ml. Lavare il tubo di estrazione BM due volte con 1 mL di mezzo completo ogni volta. Filtrare attraverso un filtro da 70 μm e raggruppare il volume con il resto della sospensione cellulare ottenuta nel passaggio 3.2.11.NOTA: un singolo tubo da 15 ml conterrà cellule da entrambe le zampe posteriori di un topo. Centrifugare celle a 400 × g per 10 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospescere il pellet cellulare in PBS. Contare le cellule con una camera Neubauer utilizzando il tampone di lisi dei globuli rossi e lo 0,04% v/v di tripano blu in PBS. 4. Colorazione delle cellule della milza, LN e BM Dividere i campioni cellulari da colorare in 3 sottogruppi: campioni cellulari per la compensazione,comprese le cellule BM di topi non trattati da colorare solo con Hoechst 33342 (d’ora in poi denominato Hoechst) e le cellule della milza di topi non trattati da utilizzare per preparare una miscela di cellule morte/vive per la compensazione del colorante a cellule morte; controllo positivo per l’analisidel ciclo cellulare, costituito da un campione di BM di topi non trattati; e campioni sperimentali contenenti campioni di milza e LN di topi non trattati e vaccinati.NOTA: Assicurarsi che vi siano abbastanza cellule della milza e LN per l’analisi di un numero sufficiente di cellule T CD8 specifiche del gag. Spesso è necessario utilizzare cellule della milza raggruppate e cellule LN raggruppate da 3 topi vaccinati e macchiare due o più campioni identici di cellule raggruppate, ciascuna contenente 3 × 106 cellule. Unire campioni identici nella fase di colorazione hoechst. Allo stesso modo, le cellule della milza e le cellule LN di 3 topi non trattati hanno colorato e fondono campioni identici alla fine. Mettere da parte un campione non macchiato di cellule della milza da un topo non trattato da utilizzare per la configurazione dello strumento e della compensazione. Preparare la miscela di cellule morte / vive per la compensazione del colorante a cellule morte (questa miscela di cellule sarà macchiata solo con il colorante a cellule morte). Riscaldare un bagno d’acqua a 65 °C. Prendi un’aliquota delle cellule della milza (~3 × 106). Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microfuga, metterla a bagnomaria a 65 °C per 5 minuti, quindi metterla immediatamente sul ghiaccio per 10 minuti. Mescolare le cellule uccise dal calore con cellule della milza vive (~ 3 × 106) in un rapporto di 1: 1 e trasferire metà della miscela in una piastra inferiore ben rotonda 96 (~ 3 × 106 cellule / pozzetto per il controllo della colorazione delle cellule morte). Colorazione di cellule morte di campioni sperimentali, controllo positivo per l’analisi del ciclo cellulare e miscela di cellule morte/vive Trasferire le cellule milza, LN, BM (3 × 106 cellule/pozzetto) e la miscela cellulare morta/viva (sezione 4.2) in una piastra a fondo tondo a 96 pozzetti, secondo lo schema di colorazione (fase 4.1), e centrifugare a 400 × g per 3 minuti a 4 °C. Risospescire ogni pellet cellulare in 50 μL di colorante a cellule morte diluito in PBS e risospesso mediante pipettaggio su e giù 3 volte immediatamente. Incubare per 30 minuti a 4 °C, al riparo dalla luce. Lavare le celle 2 volte con tampone colorante; la prima volta con 200 μL e la seconda volta con 250 μL. Per ogni lavaggio centrifugare la piastra a 400 × g per 3 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare in 20 μL di PBS. Colorazione delle cellule di membrana con multimeri e mAbs e mAbs del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC). Tenendo conto dei volumi necessari secondo lo schema di colorazione (impostazioni del citometro a flusso, Tabella 1), preparare i seguenti reagenti: Diluire mAb 2.4G2 nel tampone di colorazione secondo l’appropriata diluizione (vedi Tabella dei materiali); per ogni campione da colorare, utilizzare 10 μL di questa diluizione.NOTA: 2.4G2 mAb blocca il legame non antigene-specifico delle immunoglobuline ai recettori FcγIII e FcγII. Diluire il tetramero marcato con alloficocianina (TEtr-gag) H-2k(d) AMQMLKETI (APC) nel tampone di colorazione per ottenere la diluizione appropriata (vedere Tabella dei materiali); per ogni campione da colorare, utilizzare 20 μL di questa diluizione. Preparare la miscela di anticorpi diluendo mAbs nel tampone colorante secondo l’appropriata diluizione (vedi Tabella dei materiali)che è stata precedentemente determinata negli esperimenti di titolazione; per ogni campione da colorare, utilizzare 20 μL di questa miscela di anticorpi.NOTA: Qui sono stati utilizzati la proteina clorofilla anti-CD3e peridina (PerCP-Cy5.5) (clone 145-2C11), l’ultravioletto brillante anti-CD8a (BUV805) (clone 53-6.7) e la ficoeritrina cyanine7 anti-CD62L (PECy7) (clone MEL-14). Aggiungere 10 μL del mAb 2.4G2 precedentemente diluito (passo 4.4.1.1) e incubare per 10 minuti a 4 °C, al riparo dalla luce. Aggiungere 20 μL di Tetr-gag APC precedentemente diluito (punto 4.4.1.2) e 10 μL di H-2k(d) AMQMLKETI phycoerythrin (PE) pentamer (pent-gag). Incubare per 15 minuti a 4 °C, al riparo dalla luce. Aggiungere 20 μL della miscela di anticorpi precedentemente preparata (fase 4.4.1.3) e incubare 15 minuti a 4 °C, al riparo dalla luce.NOTA: Quindi, il volume finale è di 80 μL per pozzetto (passo 4.3.5, passaggi da 4.4.2 a 4.4.4). Lavare le celle con 200 μL di tampone colorante. Centrifugare a 400 × g per 5 min a 4 °C. Risospendare il pellet cellulare in 250 μL di tampone colorante e trasferire la sospensione cellulare in tubi da 5 mL. Aggiungere 1 mL di tampone colorante al tubo e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C. Prelevare l’aliquota delle cellule BM (3 × 106 cellule) (vedere elenco dei campioni cellulari, sezione 4.1) da utilizzare per compensare il canale di Hoechst (Hoechst 33342 è eccitato da un laser ultravioletto (impostazioni del citometro a flusso (Tabella 2)) e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 5 ml. Aggiungere 1 mL di tampone colorante al tubo e centrifugare 400 × g per 5 minuti a 4 °C. 5. Fissazione/permeabilizzazione Preparare un tampone di fissazione / permeabilizzazione fresco diluendo 1 parte di concentrato di fissazione / permeabilizzazione con 3 parti di diluente di fissazione / permeabilizzazione, secondo le istruzioni del produttore. Scartare il surnatante e pulsare vortex i campioni per disaggregare completamente il pellet. Aggiungere 1 mL del tampone di fissazione/permeabilizzazione appena preparato a ciascun tubo, compreso un tubo con cellule della milza non macchiate (3 x 106,vedere elenco dei campioni cellulari, sezione 4.1) e vortice. Incubare per 16 ore a 4 °C.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. 6. Colorazione intracellulare Colorazione Ki67 Preparare il tampone di permeabilizzazione fresco 1x diluendo il tampone di permeabilizzazione 10x con acqua distillata, secondo le istruzioni del produttore. Prima dell’uso, il tampone di permeabilizzazione 1x deve essere filtrato attraverso un filtro da 0,45 μm per eliminare gli aggregati. Diluire mAb Ki67 fluoresceina isotiocianato (FITC) (clone SolA15) nel tampone di permeabilizzazione 1x (vedere Tabella dei materiali),come determinato in precedenza negli esperimenti di titolazione (volume finale di 100 μL per campione). Aggiungere 3 mL di tampone di permeabilizzazione 1x a ciascun tubo e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Scartare il surnatante e ripetere il passaggio 6.1.3. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet cellulare in 100 μL di mAb Ki67 FITC precedentemente diluito (fase 6.1.2). Incubare per 30 minuti a RT, al riparo dalla luce. Lavare le celle 2 volte con 4 mL di tampone di permeabilizzazione 1x. Per ogni centrifuga di lavaggio a 400 × g per 5 min a RT. Risospesso il pellet cellulare in PBS considerando i seguenti volumi: 350 μL di PBS per i campioni da acquisire direttamente al citometro a flusso; 250 μL di PBS per i campioni da incubare con Hoechst poco prima della citometria a flusso (paragrafo 6.2). Colorazione del DNA Aggiungere 250 μL di 4 μg/mL di Hoechst in PBS a ciascun campione (la concentrazione finale di Hoechst è di 2 μg/mL).NOTA: Nel caso in cui siano stati preparati due o più campioni identici di 250 μL in PBS, unirli in questa fase e aggiungere un volume uguale di 4 μg/mL di soluzione di Hoechst in PBS (la concentrazione finale di Hoechst è di 2 μg/mL). Il numero di cellule influenza notevolmente la fase di colorazione del DNA. Utilizzare lo stesso numero di cella in ogni campione. Essere consapevoli del fatto che anche un numero di cellule leggermente ridotto (ad esempio, a causa della perdita di cellule nelle precedenti fasi di lavaggio) si traduce in un maggiore legame di Hoechst al DNA e in una maggiore intensità di Hoechst. Incubare per 15 minuti a RT, al riparo dalla luce. Centrifugare i campioni a 400 × g per 5 minuti a RT. Risospesciare il pellet di cella in 350 μL di PBS. 7. Preparazione di campioni di perline di compensazione Preparare 5 μL dell’anticorpo diluendo mAb nel tampone colorante in modo appropriato.NOTA: Per ogni mAb coniugato al fluorocromo utilizzato nell’esperimento, preparare il campione di perline di compensazione corrispondente. Vortex Negative Control e Anti-Rat/Hamster Ig,κ Comp Beads prima dell’uso. Per ogni campione, introdurre una goccia (~20 μL) di CompBeads a controllo negativo e una goccia di Anti-Rat/Hamster Ig,k CompBeads. Aggiungere 5 μL dell’anticorpo prediluito (fase 7.1) al tubo e pipettare su e giù. Incubare per 15 minuti a 4 °C, al riparo dalla luce. Lavare i campioni con 2 ml di tampone colorante. Centrifugare a 400 × g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet aggiungendo 500 μL di PBS a ciascun tubo e vortice. 8. Strumentazione e configurazione della compensazione e acquisizione sperimentale del campione al citometro a flusso NOTA: fare riferimento alle impostazioni del citometro a flusso (Tabella 2) per la configurazione del citometro. Configurazione generale dello strumento e della compensazione Aprire il software per l’acquisizione di campioni (vedere Tabella dei materiali)e creare un nuovo esperimento facendo clic su Nuovo esperimento nella sezione della barra multifunzione dell’area di lavoro e selezionando Nuovo esperimento vuoto. Fare doppio clic sull’esperimento creato per aprirlo. Nella finestra Impostazioni citometro, fare clic su Parametri e selezionare tutti i canali (ad esempio, PE, APC, ecc.) utilizzati nel pannello di colorazione, inclusi i parametri Forward Scatter (FSC) e Side Scatter (SSC). Selezionare la scala lineare come parametro Hoechst deselezionando la scala di log e controllare la larghezza (W) dell’impulso di tensione per FCS, SSC e Hoechst.NOTA: tutti i parametri sono visualizzati per impostazione predefinita in scala logaritmica (log), ad eccezione di FSC e SSC che sono in scala lineare. Tutti i parametri vengono analizzati dall’Area (A) e dall’Altezza (H) dell’impulso di tensione. Nel foglio di lavoro globalecreare un dot plot con FSC-A sull’asse x e SSC-A sull’asse y. Eseguire l’esempio di milza non macchiata facendo clic su Acquisisci dati nel dashboard di acquisizione. Impostare le impostazioni FSC e SSC appropriate per visualizzare le celle modificando i valori di tensione nella sezione Parametri e creare un gate per selezionare tutte le celle visualizzate nel dot plot FSC-A/SSC-A facendo clic su Polygon Gate sulla barra degli strumenti dell’area di lavoro del foglio di lavoroglobale . Visualizzare le cellule gated in istogrammi con ogni parametro di fluorescenza sull’asse x. Eseguire campioni di milza non macchiati e completamente macchiati per regolare il rilevatore di fluorescenza (PMT) in modo da avere una chiara separazione tra segnali negativi e positivi delle cellule colorate per ciascun parametro di fluorescenza. Per eseguire l’impostazione della compensazione, fare clic su Esperimento nella barra multifunzione dell’area di lavoro e nella sezione Impostazione compensazione selezionare Crea controlli di compensazione. Deselezionate Includi tubo di controllo non macchiato/pozzo (Include Unstained Control Tube/Well) e fate clic su OK.NOTA: questa operazione comporterà la creazione di un campione denominato Compensation Controls e di un foglio di lavoro normale contenente diversi fogli corrispondenti a ciascun parametro selezionato. Eseguire un campione di perline di compensazione (vedere paragrafo 7); impostare le impostazioni FSC e SSC appropriate per visualizzare le perline modificando i valori di tensione e la soglia di acquisizione di 5.000 sui parametri FSC nella finestra Del citometro. Regolare il gate P1 sulla popolazione di perline e verificare che i picchi positivi e negativi siano entrambi visibili sull’asse x. Ripetere questa operazione per ogni campione di perline di compensazione e infine registrare ogni file di esempio facendo clic su Registra dati nel dashboard di acquisizione (registrare almeno 5.000 eventi per ogni campione). Per ogni campione di perline registrato, impostare le porte P2 e P3 rispettivamente sui picchi positivi e negativi. Eseguire i campioni di cellule per la compensazione (vedere i passaggi 4.2 e 4.4.7 e i paragrafi 5 e 6). Modificare le tensioni FSC e SSC e il valore di soglia per visualizzare le celle, regolare il gate P1 e infine registrare ogni file di esempio (registrare almeno 10.000 eventi). Impostare le porte P2 e P3 rispettivamente sui picchi positivi e negativi.NOTA: per la compensazione del canale di Hoechst, utilizzare G0/G1 come picco negativo (P3) e G2/M come positivo (P2). Fare clic su Esperimento nella sezione della barra multifunzione dell’area di lavoro e nella sezione Impostazione compensazione selezionare Calcola compensazione. Assegna un nome all’impostazione di compensazione creata, al collegamento e salvala nell’esperimento corrente. Acquisizione sperimentale di campioni Aprire un campione facendo clic su Nuovo campione sulla barra degli strumenti del browser e creare la strategia di gating nel foglio di lavoro globale.NOTA: la strategia di gating di acquisizione del campione è simile a quella dell’analisi del campione, descritta nella Figura 3 e nella sezione 9. Visualizzare la popolazione di tutti gli eventi in un istogramma con CD3-A sull’asse x. Creare un Interval Gate per selezionare solo le celleCD3 +. Nel dashboard di acquisizioneselezionare il gate di archiviazione come Tutti gli eventi per i campioni LN e Tutti gli eventi o Le celle CD3+ per i campioni di milza. Esegui i campioni sperimentali a bassa velocità e infine registra tutti i file assicurandoti di raccogliere almeno 100-200 cellule T CD8 antigene-specifiche per ogni campione dai topi vaccinati.NOTA: la dimensione del file dei campioni sperimentali è solitamente grande (30-120 MB), specialmente quando la frequenza delle cellule T CD8 antigene-specifiche è bassa. Quindi, è necessario raccogliere un numero elevato di eventi (> 1 ×10 6) per registrare almeno 100-200 cellule T CD8 antigene-specifiche. I file di grandi dimensioni potrebbero rallentare il successivo processo di analisi dei dati. L’acquisizione di sole cellule CD3+ in campioni di milza (vedere il passaggio 8.2.2 sopra) è utile per mantenere le dimensioni del file più piccole. Eseguire e registrare il controllo positivo per l’analisi del ciclo cellulare, cioè il campione BM di topi non trattati. 9. Analisi dei dati Aprire il software (vedere Tabella dei materiali)e creare diversi gruppi corrispondenti ai diversi organi da analizzare facendo clic su Crea gruppo nella sezione della barra multifunzione dell’area di lavoro (ad esempio, creare un gruppo “a-LNs”; “b-milza”; “c-BM”).NOTA: i gruppi appena creati appariranno nell’elenco dei gruppi, mentre il gruppo “Compensazione” verrà generato automaticamente dal software. Aprire la finestra Modifica gruppo facendo doppio clic sul nome del gruppo e verificare che i gruppi appena creati siano sincronizzati. In caso contrario, inserire un segno di spunta sulla funzione Sincronizzato. Trascinare ogni file .fcs nel gruppo corrispondente. Crea la strategia di gating iniziando con il gruppo “a-LNs”. Fare doppio clic sul campione completamente macchiato nel gruppo per aprire la finestra del grafico; gli assi x e y sono etichettati come nei file fcs (vedere impostazioni del citometro a flusso, Tabella 2). Visualizzare gli eventi totali acquisiti per questo campione in un dot plot con DNA-A sull’asse x e DNA-W sull’asse y. Selezionare solo la popolazione di celle singole facendo clic su Rettangolo nella sezione dello strumento gating della finestra del grafico.NOTA: le singole cellule hanno valori di DNA-A come segue: 2N (basso): tra 2N e 4N (intermedio), o uguale a 4N (alto), mentre i valori di DNA-W sono identici per tutti loro (fase 1 della Figura 3). Fare doppio clic al centro del cancello rettangolare per visualizzare celle singole in un dot plot con parametro FSC-A sull’asse x e colorante a cellule morte sull’asse y. Selezionare solo la popolazione di celle vive facendo clic su Poligono nella sezione dello strumento gating della finestra del grafico. Le cellule vive sono negative per il colorante a cellule morte (fase 2 della Figura 3). Fate doppio clic al centro del gate poligonale per visualizzare le celle in un dot plot con il parametro FSC-A sull’asse x e il parametro SSC-A sull’asse y. Fare clic su Rettangoloe creare un cancello “rilassato” per includere tutte le singole celle vive in quelgrafico 12 (passaggio 3 della Figura 3). Fare doppio clic al centro del cancello “rilassato” per visualizzare le celle in un dot plot con CD3 sull’asse x e CD8 sull’asse y. Selezionare le celle CD3+CD8+ facendo clic su Poligono (passaggio 4 della Figura 3). Fare doppio clic al centro del gate CD3+CD8+ per visualizzare le celle in un dot plot con Tetr-gag sull’asse x e Pent-gag sull’asse y. Selezionare le cellule T CD8 antigene-specifiche (positive sia per Tetr-gag che per Pent-gag) cliccando su Polygon (step 5 of Figure 3). Fare doppio clic al centro del gate specifico del gag per visualizzare le celle in un dot plot con DNA-A sull’asse x e Ki67 sull’asse y (Figura 4). Selezionare le celle nelle diverse fasi del ciclo cellulare facendo clic su Quad nella sezione dello strumento gating della finestra del grafico.NOTA: Le cellule in fase G0 sono cellule basse Ki67neg-DNA (quadrante in basso a sinistra); le cellule in G1 sono Ki67pos-DNA basso (quadrante in alto a sinistra); le cellule in S-G2/M sono Ki67pos-DNA intermedio/alto (quadrante in alto a destra) (Figura 4). Copiare la strategia di gating creata in un campione nel gruppo corrispondente per applicare i gate a tutti i campioni del gruppo. Ripetere i passaggi da 9,5 a 9,18 per il “gruppo a-LN”. Verificare che tutte le porte siano appropriate per ciascun campione del gruppo “b-milza”. Per analizzare il ciclo cellulare tra le cellule BM (controllo positivo), fare clic al centro del cancello “rilassato” per visualizzare le cellule in un dot plot con DNA-A sull’asse x e Ki67 sull’asse y. Verificare che tutte le porte siano appropriate per ogni campione dei 3 gruppi (ad esempio, per le cellule di milza, LN e BM).NOTA: Single cell population gate (step 9.7) e Quad gate for cell cycle (step 9.17) possono avere coordinate di gate diverse in campioni diversi, principalmente a causa delle possibili lievi differenze dell’intensità del colorante Hoechst tra i campioni (sezione 6.2). Per questo motivo, potrebbe essere necessario modificare il single cell population gate e il Quad gates per il ciclo cellulare in ciascun campione. Questo verrà fatto come segue: fare doppio clic sul nome del gruppo e rimuovere la sincronizzazione dalle proprietà del gruppo. Questa operazione permette la modifica dei cancelli in un campione senza modificare gli stessi cancelli in tutti gli altri campioni del gruppo. Dopo la rimozione della sincronizzazione, modificare i cancelli se necessario. Per visualizzare i risultati ottenuti da questa analisi, fare clic su Editor layout nella sezione della barra multifunzione dell’area di lavoro per aprirla. Trascinate ogni gate della strategia di gating nel riquadro di esempio nell’editor di layout e posizionate i grafici in base alla sequenza della strategia di gating. Se necessario, modificare il tipo di grafico facendo doppio clic sul plottaggio corrispondente nel layout e selezionando il tipo appropriato nella finestra Definizione grafico. Fare clic sul gruppo e scorrere per funzioni sulla barra multifunzione del layout per visualizzare i risultati ottenuti in ciascun organo e confrontare diversi campioni.