בדיקת ציטומטריית זרימה מבוססת DNA/Ki67 לניתוח מחזור תאים של תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן בעכברים מחוסנים

עכברים שוכנו במתקן החיות Plaisant, והעבודה בוצעה תחת אישור משרד הבריאות האיטלקי מספר 1065/2015-PR. הפרוטוקול פעל על פי הנחיות הטיפול בבעלי חיים על פי חוקים ומדיניות לאומיים ובינלאומיים (הוראת UE 2010/63/UE; צו חקיקה איטלקי 26/2014). 1. הכנת פתרון בינוני וכתים הכן בינוני מלא: מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בינוני עם 2 mM גלוטמין, 100 U / mL פניצילין / סטרפטומיצין, 50 μM בטא-mercaptoethanol, ו 10% נפח / נפח (v / v) של סרום בקר עוברי (FBS) הכן חיץ כתמים: תמיסת מלח חוצצת פוספט ללא Ca2 +/ Mg2 + (PBS) עם 1% משקל / נפח (w / v) אלבומין סרום בקר (BSA) ו 2 mM מלח דיסודיום חומצה אתילנדימינטראצטית (EDTA) 2. טיפול בעכבר ראש 7-8 שבועות, עכברי Balb/c נקבה על ידי הזרקה תוך שרירית (i.m.) בשריר הארבע ראשי של וירוס חיסוני אנושי (HIV)-1-איסור-איסור-שימפנזה אדנו-ויראלי (ChAd3-gag) עם מנה של 107 חלקיקים ויראליים. ב 1-4 חודשים לאחר priming, להגביר פעם אחת את העכברים על ידי i.m. הזרקה של HIV-1-איסור פרסום-ביטוי וירוס vaccinia אנקרה שונה (MVA-gag) עם מנה של 106 יחידות יוצרות פלאק. ביום 3 לאחר דחיפה, להקריב את העכברים מוגברת על ידי נקע צוואר הרחם, ולנתח אותם במקביל עם עכברים מטופלים. קוצרים את ה-LNs המנקזים את שריר הארבע ראשי (כסל, פופליטאלי ומשתנה) ואת הטחול מעכברים מוגברים ולא מטופלים. יתר על כן, לאסוף את BM משתי הרגליים האחוריות מעכברים מטופלים, ולהשתמש BM זה עבור הגדרות cytometer זרימה כמו שליטה חיובית עבור ניתוח מחזור התא (איור 2).הערה: צור ChAd3-gag ו- MVA-gag וקטורים כפי שתואר בעבר12,15,16,17. 3. בידוד של תאי LN, טחול ו- BM מתנקזים בידוד של תאי טחול ו- LN מניחים 5 מ”ל של מדיום מלא בכל אחד משני צינורות 15 מ”ל, ולשמור אותם על קרח, מוכן לאיברים לאיסוף. להקריב עכבר בוגר על ידי פריקת צוואר הרחם. מניחים את העכבר על גבו, ומעקרים את פני העור עם 70% v/ v אתנול. כדי לאסוף LNs מפשעתי, לעשות ~ 1 ס”מ אורך חתך על הבטן עם מספריים, ולמתוח את החתירה עם המלקחיים. דמיינו LNs מפשעתי על פני השטח הפנימיים של העור, וקצור אותם עם המלקחיים. מניחים את LNs מפשעתי באחד משני צינורות 15 מ”ל מוכן בשלב 3.1.1. כדי לאסוף את הטחול, לעשות קיסך צפק עם מספריים ולהסיר את הטחול. לאחר חיתוך רקמת החיבור שמסביב, מניחים את הטחול לתוך צינור 15 מ”ל השני שהוכן בשלב 3.1.1. כדי לאסוף LNs כסל, להזיז את המעיים הצידה לדמיין LNs iliac קרוב vena קאווה נחות, ולאחר מכן לאסוף אותם באמצעות מלקחיים. מקם את ה- LNs הכסל באותה שפופרת המכילה את ה- LNs המגיתיים.הערה: כדי להשיג מספיק תאי LN להכתמה (ראה סעיף 4), לעתים קרובות יש צורך לאגר חלונות קופצים, מפשעתיים, ו- iliac LNs מעכבר אחד. כל ה-LNs האלה מרוקנים את שריר הארבע ראשי (האתר של i.m. חיסון). פרוטוקול זה משתמש רק בצינור אחד של 15 מ”ל של LNs מקבצים מאותבים. כדי לאסוף LNs popliteal, לתפוס את העור של הרגליים האחוריות בעדינות למשוך אותו כלפי מטה כדי לחשוף את השרירים. לאחר מכן, הכנס את המלקחיים בין השרירים מתחת למפרק הברך, ולאסוף את LNs popliteal. למקם את LNs popliteal באותו צינור המכיל LNs מפשעתי וכסל.הערה: ראה הערה לאחר 3.1.7. מניחים את הטחול לתוך מסננת תא 70 מיקרומטר בתוך צלחת תרבות 60 מ”מ מלא 5 מ”ל של מדיום מלא. בעזרת בוכנה מזרק 5 מ”ל, בעדינות לרסק את האיבר עד פירוק מלא שלה. הסר מסננת, ולהעביר את השעיית התא צינור נקי 15 מ”ל. מוסיפים 5 מ”ל של מדיום מלא לצלחת התרבות, ושטפים בזהירות את המנה ואת המסננת כדי להבטיח שכל התאים נמצאו. בריכה עם שאר התלוי של תא הטחול לתוך צינור 15 מ”ל. עבור LNs מפשעתי, iliac ו- popliteal מרופדים, הכינו השעיית תא בודד בעקבות הליך דומה לזה המשמש בשלבים 3.1.9 עד 3.1.11 עבור הטחול. תאי צנטריפוגות ב 400 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). השלך את supernatant, ו resuspend כדורי התא PBS. לספור את התאים עם תא Neubauer באמצעות מאגר תמה תא דם אדום 0.04% v / v טריפן כחול PBS. בידוד של תאי BM מניחים 5 מ”ל בינוני מלא בצינור 15 מ”ל, ולשמור אותו על קרח, מוכן לאוסף של רגליים אחוריות. להקריב עכבר בוגר על ידי פריקת צוואר הרחם. לחטא את פני העור עם 70% v / v אתנול. בצע חתך רוחבי ~ 1 ס”מ על העור הגחון עם מספריים, לתפוס בחוזקה את העור משני צידי החתך, ולמשוך בעדינות כלפי מטה כדי לחשוף את השרירים של הרגליים האחוריות. כדי לחסל את העור מהחלק האחורי של הרגליים האחוריות, שמירה על העכבר בתנוחה supine, למקם את המהדק מתחת לברך, ולמשוך כלפי מעלה כדי לחשוף את השרירים. חותכים את העצמות בשתי הגפיים של רגל אחורית אחת: מפרק האגן / הירך והקרסול. העבר את שתי הרגליים האחוריות לצינור 15 מ”ל מוכן בשלב 3.2.1. שמור את הצינור על קרח. קח את הרגליים האחוריות מהצינור 15 מ”ל ולהעביר אותם לנייר טישו. חותכים את הרגליים האחוריות ממש מתחת למפרק הברך כדי להסיר את השוקה. לנתח את עצם הירך ואת השוקה מן השרירים שמסביב, להסיר רקמות עודפות באמצעות מספריים, ולהרטיב את נייר הרקמה. חותכים את העצם מסתיים עם מספריים כדי לחשוף את פיר מח העצם הפנימי. הכנס את השוקה ואת עצם הירך לתוך צינור החילוץ BM (ראה הכנה 3.2.9.1-3.2.9.218), עם הקצה הרחב ביותר בתחתית. חותכים טיפ פיפטה 200 μL בקו ממש מעל סוף הקצה בקו 100 μL. מניחים את החלק האמצעי בחלק העליון והגדול יותר של הקצה, ומניחים אותו בצינור מיקרופוגה 1.5 מ”ל. לסובב את צינור החילוץ BM ב 800 × גרם במשך 1 דקות. להשליך את העצם, ובמרץ resuspend הכדור ב 1 מ”ל של מדיום מלא כדי להסיר את כל האשכולות. סנן את ההשעיה של התא באמצעות מסנן 70 מיקרומטר שהונח על גבי צינור 15 מ”ל. לשטוף את צינור החילוץ BM פעמיים עם 1 מ”ל של מדיום מלא בכל פעם. סנן דרך מסנן 70 מיקרומטר וקשף את עוצמת הקול עם שאר ההשעיה של התא שהתקבל בשלב 3.2.11.הערה: צינור יחיד של 15 מ”ל יכיל תאים משתי הרגליים האחוריות של עכבר. תאי צנטריפוגות ב 400 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). השלך את supernatant, ו resuspend גלולה התא PBS. לספור את התאים עם תא Neubauer באמצעות מאגר תמה תא דם אדום 0.04% v / v טריפן כחול PBS. 4. כתמים של תאי טחול, LN ו- BM חלק דגימות תאים להיות מוכתם ל 3 תת קבוצות: דגימות תאים לפיצוי, כולל תאי BM מעכברים מטופלים להיות מוכתם רק עם Hoechst 33342 (מעתה ואילך המכונה Hoechst) ותאי טחול מעכברים מטופלים לשמש להכנת תערובת תאים מתים / חיים לפיצוי צבע תא מת; שליטה חיובית עבור ניתוח מחזור התא, המורכב מדגם BM מעכברים לא מטופלים; ודגימות ניסיוניות המכילות דגימות טחול ו- LN מעכברים לא מטופלים ומחסן.הערה: ודא שיש מספיק תאי טחול ו- LN לניתוח של מספרים מספיקים של תאי CD8 T ספציפיים למחסום. לעתים קרובות יש צורך להשתמש בתאי טחול מקבצים ותאי LN מ-3 עכברים מחוסנים ולהכתים שתי דגימות זהות או יותר של תאים מאוגדים, שכל אחת מהן מכילה 3 × 106 תאים. מזג דוגמאות זהות בשלב של הכתמת היצ’סט. באופן דומה, תאי טחול מלוגדים כתמים ותאי LN מ-3 עכברים לא מטופלים, וממזגים דגימות זהות בסוף. הקצה דגימה לא נגועה של תאי טחול מעכבר לא מטופל שישמש להגדרת מכשירים ופיצויים. הכן תערובת תאים מתים / חיים לפיצוי צבע תא מת (תערובת זו של תאים תהיה מוכתמת רק עם צבע התא המת). לחמם אמבט מים ב 65 °C (5 °F). קח aliquot של תאי טחול (~ 3 × 106). להעביר את ההשעיה התא לצינור microfuge, למקם אותו באמבט המים ב 65 °C (5 דקות), ולאחר מכן מיד למקם אותו על קרח במשך 10 דקות. מערבבים את התאים מוכי החום עם תאי טחול חיים (~3 × 106) ביחס של 1:1, ומעבירים מחצית מהתערובת לצלחת תחתונה עגולה של 96 (כ-3 × 106 תאים/גם לבקרת הכתמת התא המת). כתמי תאים מתים של דגימות ניסיוניות, שליטה חיובית לניתוח מחזור התאים ותערובת תאים מתים/חיים העבר טחול, LN, תאי BM (3 × 106 תאים / טוב), ואת תערובת התא המת / חי (סעיף 4.2) לתוך צלחת עגולה 96 היטב, על פי ערכת הכתמים (שלב 4.1), וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (50 °F). resuspend כל גלולה תא ב 50 μL של צבע תא מת מדולל PBS, ו resuspened על ידי צינור למעלה ולמטה 3 פעמים מיד. דגירה במשך 30 דקות ב 4 °C (6 °F), מוגן מפני אור. לשטוף תאים 2 פעמים עם חוצץ כתמים; בפעם הראשונה עם 200 μL והפעם השנייה עם 250 μL. עבור כל צנטריפוגה לשטוף את הצלחת ב 400 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (70 °F). להשליך את supernatant, ו resuspend גלולה התא ב 20 μL של PBS. מכתים תאי ממברנה עם קומפלקס היסטו-תאימות מרכזי (MHC) -מולטימרים ו- mAbs. אם ניקח בחשבון את הכרכים הדרושים על פי ערכת הכתמים (הגדרות Cytometer זרימה, טבלה 1), להכין את ריאגנטים הבאים: לדלל mAb 2.4G2 במאגר הכתמים על פי הדילול המתאים (ראה טבלת חומרים); עבור כל דגימה להיות מוכתם, להשתמש 10 μL של דילול זה.הערה: 2.4G2 mAb חוסם כריכה לא ספציפית אנטיגן של אימונוגלובולינים לקולטנים FcγII ו- FcγII. לדלל את H-2k(d) AMQMLKETI allophycocyanin (APC)-תווית טטרמר (Tetr-gag) במאגר הכתמים כדי לקבל את הדילול המתאים (ראה טבלת חומרים); כדי שכל דגימה תהיה מוכתמת, השתמש ב- 20 μL של דילול זה. הכן את תערובת הנוגדנים על ידי דילול mAbs במאגר הכתמים על פי הדילול המתאים (ראה טבלת חומרים) שנקבעה בעבר בניסויי טיטריון; כדי שכל דגימה תהיה מוכתמת, השתמש ב-20 מיקרו-אל של תערובת נוגדנים זו.הערה: כאן, חלבון כלורופיל peridin אנטי CD3e (PerCP-Cy5.5) (שיבוט 145-2C11), אנטי CD8a מבריק אולטרה סגול (BUV805) (שיבוט 53-6.7), ו נגד CD62L phycoerythrin ציאנין7 (PECy7) (שיבוט MEL-14) שימשו. הוסף 10 μL של 2.4G2 mAb מדולל בעבר (שלב 4.4.1.1), ודגרה במשך 10 דקות ב 4 °C (4 °F), מוגן מפני אור. הוסף 20 μL של נגמ”ש Tetr-gag מדולל בעבר (שלב 4.4.1.2) ו 10 μL של H-2k(ד) AMQMLKETI phycoerythrin (PE) מחומש (pent-gag). דגירה במשך 15 דקות ב 4 °C (5 °F), מוגן מפני אור. הוסף 20 μL של תערובת נוגדנים שהוכן בעבר (שלב 4.4.1.3), ודגור 15 דקות ב 4 °C (70 °F), מוגן מפני אור.הערה: לפיכך, נפח סופי הוא 80 μL לבאר (שלב 4.3.5, שלבים 4.4.2 עד 4.4.4). לשטוף תאים עם 200 μL של חוצץ כתמים. צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). resuspend גלולה התא ב 250 μL של חוצץ כתמים, ולהעביר את ההשעיה התא 5 mL צינורות. הוסף 1 מ”ל של חוצץ כתמים לצינור, וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). קח את aliquot של תאי BM (3 × 106 תאים) (ראה רשימה של דגימות תאים, סעיף 4.1) לשמש כדי לפצות את ערוץ Hoechst (Hoechst 33342 מתרגש על ידי לייזר אולטרה סגול (הגדרות cytometerזרימה (טבלה 2)), ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור 5 מ”ל. הוסף 1 מ”ל של חוצץ כתמים לצינור, וצנטריפוגה 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). 5. קיבעון/פרמיביליזציה הכן חיץ קיבעון/פרמזיביליזציה טרי על ידי דילול חלק אחד של תרכיז קיבעון/פרמזיביליזציה עם 3 חלקים של דילול קיבעון/פרמזיביליזציה, בהתאם להוראות היצרן. להשליך את מערבולת supernatant ודופק הדגימות כדי לנטרל לחלוטין את הכדור. הוסף 1 מ”ל של חיץ קיבעון / permeabilization מוכן טרי לכל צינור, כולל צינור עם תאי טחול לא מזוהמים (3 x 106, ראה רשימה של דגימות תאים, סעיף 4.1) ומערבולת. דגירה במשך 16 שעות ב 4 °C (5 °F).הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. 6. כתמים תאיים כתמי Ki67 הכן חיץ permeabilization טרי 1x על ידי דילול חיץ permeabilization 10x עם מים מזוקקים, על פי הוראות היצרן. לפני השימוש, מאגר permeabilization 1x חייב להיות מסונן באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר כדי לחסל אגרגטים. לדלל mAb Ki67 פלואורסצין איזוטיויאנאט (FITC) (שיבוט SolA15) במאגר permeabilization 1x (ראה טבלת חומרים),כפי שנקבע בעבר בניסויי טיטרציה (נפח סופי של 100 μL לדגימה). הוסף 3 מ”ל של חיץ פרמזביליזציה 1x לכל צינור, וצנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). השלך את שלב העל וחזר על שלב 6.1.3. השלך את supernatant, ו resuspend גלולה התא ב 100 μL של mAb Ki67 FITC מדולל בעבר (שלב 6.1.2). דגירה במשך 30 דקות ב RT, מוגן מפני אור. לשטוף תאים 2 פעמים עם 4 מ”ל של חיץ permeabilization 1x. עבור כל צנטריפוגה לשטוף ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב RT. Resuspend גלולה התא PBS בהתחשב בנפחים הבאים: 350 μL של PBS עבור הדגימות שנרכשו ישירות ב cytometer הזרימה; 250 μL של PBS עבור הדגימות להיות דגירה עם Hoechst זמן קצר לפני ציטומטריה זרימה (סעיף 6.2). כתמי דנ”א הוסף 250 μL של 4 מיקרוגרם / מ”ל Hoechst ב PBS לכל מדגם (הריכוז הסופי של Hoechst הוא 2 מיקרוגרם / מ”ל).הערה: במקרה שתי דגימות זהות או יותר של 250 μL ב- PBS הוכנו, למזג אותם בשלב זה, ולהוסיף נפח שווה של 4 מיקרוגרם / mL פתרון Hoechst ב PBS (הריכוז הסופי של Hoechst הוא 2 מיקרוגרם / מ”ל). מספר התאים משפיע מאוד על שלב הכתמת הדנ”א. השתמש באותו מספר תא בכל דגימה. שים לב כי אפילו מספר תא מופחת מעט (למשל, עקב אובדן תאים בשלבי כביסה קודמים) גורם כריכה Hoechst גבוה יותר ל- DNA ועוצמת Hoechst גבוהה יותר. דגירה במשך 15 דקות ב RT, מוגן מפני אור. צנטריפוגות הדגימות ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב RT. resuspend גלולה התא ב 350 μL של PBS. 7. הכנת דגימות חרוזים לפיצוי הכן 5 μL של הנוגדן על ידי דילול mAb במאגר הכתמים כראוי.הערה: עבור כל mAb מצומד פלואורוכרום המשמש בניסוי, להכין את מדגם חרוז הפיצוי המתאים שלה. מערבולת שליטה שלילית ונגד חולדה / אוגר Ig, κ Comp חרוזים לפני השימוש. עבור כל מדגם, להציג טיפה אחת (~ 20 μL) של CompBeads של שליטה שלילית טיפה אחת של אנטי חולדה / אוגר Ig, k CompBeads. הוסף 5 μL של הנוגדן prediluted (שלב 7.1) לצינור, וצינור למעלה ולמטה. דגירה במשך 15 דקות ב 4 °C (5 °F), מוגן מפני אור. לשטוף דגימות עם 2 מ”ל של חוצץ כתמים. צנטריפוגה ב 400 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). להשליך את supernatant, ו resuspend הכדור על ידי הוספת 500 μL של PBS לכל צינור מערבולת. 8. מערך מכשירים ופיצויים ורכישת מדגם ניסיוני בציטומטר הזרימה הערה: עיין בהגדרות ציטומטר הזרימה (טבלה 2) עבור תצורת cytometer. מכשיר כללי וכיוונון פיצוי פתח את התוכנה לרכישה לדוגמה (ראה טבלת חומרים ) וצור ניסוי חדש על-ידי לחיצה על ניסוי חדש במקטע רצועת הכלים שלסביבת העבודה ובחירה בניסוי ריק חדש. לחץ פעמיים על הניסוי שנוצר כדי לפתוח אותו. בחלון הגדרות Cytometer, לחץ על פרמטרים ובחר את כל הערוצים (למשל, PE, APC וכו ‘) המשמשים בלוח הכתמים כולל פיזור קדימה (FSC) ופרמטרים של פיזור צד (SSC). בחר קנה מידה ליניארי כפרמטר Hoechst על-ידי ביטול הסימון של סולם יומן הרישום ובדוק את הרוחב (W) של פעימת המתח עבור FCS, SSC ו- Hoechst.הערה: כל הפרמטרים מוצגים כברירת מחדל בקנה מידה לוגריתמי (יומן רישום), למעט FSC ו- SSC הנמצאים בקנה מידה ליניארי. כל הפרמטרים מנותחים על ידי האזור (A) והגובה (H) של פעימת המתח. בגליון העבודה הכללי, צור התוויית נקודות עם FSC-A בציר ה- x ו- SSC-A בציר ה- y. הפעל את דגימת הטחול הלא נגועה על-ידי לחיצה על השג נתונים בלוח המחוונים של הרכישה. הגדר את הגדרות ה- FSC וה- SSC המתאימות כדי להציג באופן חזותי את התאים על-ידי שינוי ערכי המתח במקטע פרמטרים וצור שער לבחירת כל התאים המוצגים בהתוויה של הנקודות FSC-A/A/SSC-A על-ידי לחיצה על שער מצולע בסרגל הכלים של סביבת העבודה של גליון העבודההכללי . הצג את התאים המגודרים בהיסטוגרמה עם כל פרמטר פלואורסצנטיות בציר ה- x. הפעל דגימות טחול לא מוכתמות ומוכתמות לחלוטין כדי להתאים את גלאי הפלואורסצנטיות (PMT) להפרדה ברורה בין אותות שליליים וחיוביים של התאים המוכתמים עבור כל פרמטר פלואורסצנטי. כדי לבצע הגדרת פיצוי, לחץ על התנסות ברצועת הכלים של סביבת העבודה ותחת המקטע הגדרת פיצוי, בחר צור פקדי פיצוי. בטל את הסימון כלול צינור בקרה/באר לא נגוע ולחץ על אישור.הערה: פעולה זו תגרום ליצירת דגימה בשם בקרת פיצוי וגליון עבודה רגיל המכיל מספר גליונות המתאימים לכל פרמטר שנבחר. הפעלת מדגם של חרוזי פיצוי (ראה סעיף 7); הגדר את הגדרות ה- FSC וה- SSC המתאימות כדי לדמיין את החרוזים על-ידי שינוי ערכי המתח וסף הרכישה של 5,000 בפרמטרים של FSC בחלון Cytometer. התאם את שער P1 באוכלוסיית החרוזים, ובדוק שהפסגות החיוביות והשליליות נראות שתיהן על ציר ה- x. חזור על פעולה זו עבור כל דגימת חרוז פיצוי, ולבסוף הקלט כל קובץ לדוגמה על-ידי לחיצה על נתוני רשומה בלוח המחוונים של הרכישה (רשמה לפחות 5,000 אירועים עבור כל מדגם). עבור כל מדגם חרוזים מוקלט, קבעו את שערי P2 ו- P3 על הפסגות החיוביות והשליליות, בהתאמה. הפעל את דגימות התא לפיצוי (ראה שלבים 4.2 ו- 4.4.7, וסעיפים 5 ו- 6). שנה את המתחים FSC ו- SSC ואת ערך הסף כדי לדמיין את התאים, להתאים שער P1 ולבסוף להקליט כל קובץ לדוגמה (להקליט לפחות 10,000 אירועים). הגדר את שערי P2 ו- P3 על הפסגות החיוביות והשליליות, בהתאמה.הערה: עבור הפיצוי של ערוץ Hoechst, להשתמש G0/ G1 כמו השיא השלילי (P3) ואת G2/ M כחיובי (P2). לחץ על התנסות במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה ובסעיף הגדרת פיצוי, בחר חשב פיצוי. תן שם להגדרת הפיצוי שנוצרה, קשר ושמור אותה בניסוי הנוכחי. רכישת מדגם ניסיוני פתח דגימה על-ידי לחיצה על דגימה חדשה בסרגל הכלים של הדפדפן וצור את אסטרטגיית הגינג בגליון העבודה הכללי.הערה: אסטרטגיית הגטינג של רכישת מדגם דומה לזו של ניתוח מדגם, המתואר באיור 3 ובסעיף 9. הצג את כל אוכלוסיית האירועים בהיסטוגרמה עם CD3-A בציר ה- x. צור שער מרווח כדי לבחור רק את התאים CD3+ . בלוח המחוונים של הרכישה, בחר שער אחסון כ’כל האירועים’ עבור דוגמאות LN, ואת כל האירועים או CD3+ תאים עבור דוגמאות טחול. הפעל את הדגימות הניסיוניות במהירות נמוכה, ולבסוף להקליט את כל הקבצים הקפד לאסוף לפחות 100-200 תאי CD8 T ספציפיים אנטיגן עבור כל מדגם מן העכברים מחוסנים.הערה: גודל הקובץ של דגימות ניסיוניות הוא בדרך כלל גדול (30-120 MB), במיוחד כאשר התדירות של תאי CD8 T ספציפיים אנטיגן הוא נמוך. לפיכך, יש לאסוף מספר גבוה של אירועים (> 1 ×10 6) כדי להקליט לפחות 100-200 תאי CD8 T ספציפיים לאנטיגן. קבצים גדולים עשויים להאט את תהליך ניתוח הנתונים הבא. רכישת CD3+ תאים בלבד בדגימות טחול (ראה שלב 8.2.2 לעיל) שימושית לשמירה על גודל הקובץ קטן יותר. הפעל ורשום את הפקד החיובי עבור ניתוח מחזור התא, כלומר, דגימת BM מעכברים שלא טופלו. 9. ניתוח נתונים פתח את התוכנה (ראה טבלת חומרים ) וצור קבוצות שונות המתאימות לאיברים השונים שיש לנתח על-ידי לחיצה על צור קבוצה במקטע רצועת הכלים שלסביבת העבודה (כלומר, צור קבוצה “a-LNs”; “טחול ב”; “C-BM”).הערה: קבוצות חדשות שנוצרו יופיעו ברשימת הקבוצות, בעוד שהקבוצה “פיצוי” נוצרת באופן אוטומטי על-ידי התוכנה. פתח את החלון שנה קבוצה על-ידי לחיצה כפולה על שם הקבוצה ובדוק שהקבוצות החדשות שנוצרו מסונכרנות. אם לא, הוסף סימן ביקורת על הפונקציה מסונכרנת. גרור כל קובץ .fcs בקבוצה המתאימה לו. צור את אסטרטגיית הגטינג החל מקבוצת “a-LNs”. לחץ פעמיים על המדגם המוכתם לחלוטין בקבוצה כדי לפתוח את חלון הגרף; ציר x ו- y מסומנים כמו בקבצי fcs (ראה הגדרות ציטומטר זרימה, טבלה 2). הצג את סך האירועים שנרכשו עבור מדגם זה בחלקת נקודות עם DNA-A על ציר x ו- DNA-W בציר ה- y. בחר רק את אוכלוסיית התא הבודד על-ידי לחיצה על מלבן במקטע הכלי gating של חלון התרשים.הערה: לתאים בודדים יש ערכי DNA-A כדלקמן: 2N (נמוך): בין 2N ל- 4N (ביניים), או שווה ל- 4N (גבוה), בעוד שערכי DNA-W זהים לכולם (שלב 1 באיור 3). לחץ פעמיים במרכז השער המלבני כדי להציג תאים בודדים בפתק נקודה עם פרמטר FSC-A בציר x וצבע תא מת בציר ה- y. בחר רק את אוכלוסיית התאים החיים על-ידי לחיצה על מצולע במקטע כלי הגינג של חלון התרשים. תאים חיים הם שליליים לצבע התא המת (שלב 2 באיור 3). לחץ פעמיים במרכז השער המצולעת כדי להציג את התאים בתיוו נקודה עם פרמטר FSC-A בציר x ו- SSC-A על ציר ה- y. לחץ על מלבן, וצור שער “רגוע” שיכלול את כל התאים החיים הבודדים בגרף12 (שלב 3 באיור 3). לחץ פעמיים במרכז השער “הרגוע” כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם CD3 בציר x ו- CD8 בציר ה- y. בחר את התקליטור+CD8+ תאים על ידי לחיצה על מצולע (שלב 4 באיור 3). לחץ פעמיים במרכז ה- CD3+CD8+ השער כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם Tetr-gag על ציר ה- x ו- Pent-gag על ציר ה- y. בחרו את תאי ה-CD8 T הספציפיים לאנטיגן (חיוביים הן עבור Tetr-gag והן עבור Pent-gag) על ידי לחיצה על מצולע (שלב 5 באיור 3). לחץ פעמיים במרכז השער הספציפי למחסום כדי להציג את התאים בחלקת נקודות עם DNA-A על ציר ה- x ו- Ki67 בציר ה- y (איור 4). בחר את התאים בשלבי מחזור התא השונים על-ידי לחיצה על Quad במקטע הכלי gating של חלון התרשים.הערה: תא בשלב G0 הם תאים נמוכים Ki67neg-DNA (רבע שמאלי תחתון); תאים ב- G1 הם Ki67pos-DNA נמוך (רבע שמאלי עליון); תאים ב-S-G2/M הם Ki67pos-DNA ביניים/גבוה (רבע ימני עליון)(איור 4). העתק את אסטרטגיית הגטינג שנוצרה במדגם אחד לקבוצה המתאימה כדי להחיל את השערים על כל הדגימות של הקבוצה. חזור על שלבים 9.5 עד 9.18 עבור “קבוצת a-LN”. בדוק שכל השערים מתאימים לכל דגימה של קבוצת “b-spleen”. כדי לנתח את מחזור התא בין תאי ה- BM (שליטה חיובית), לחץ במרכז השער “הרגוע” כדי להציג את התאים בחלקת נקודה עם DNA-A בציר x ו- Ki67 בציר ה- y. בדוק שכל השערים מתאימים לכל דגימה של 3 הקבוצות (כלומר, לתאים מטחול, LN ו- BM).הערה: שער אוכלוסיית תאים בודדים (שלב 9.7) ושער מרובע למחזור התא (שלב 9.17) עשויים להיות קואורדינטות שער שונות בדגימות שונות, בעיקר בשל ההבדלים הקלים האפשריים של עוצמת הצבע Hoechst בין דגימות (סעיף 6.2). מסיבה זו, ייתכן שיהיה צורך לשנות את שער אוכלוסיית התא הבודד ואת שערי Quad עבור מחזור התא בכל מדגם. פעולה זו תיעשה באופן הבא: לחץ פעמיים על שם הקבוצה, והסר את הסינכרון ממאפייני הקבוצה. פעולה זו מאפשרת את שינוי השערים במדגם אחד מבלי לשנות את אותם שערים בכל הדגימות האחרות של הקבוצה. לאחר הסרת הסינכרון, שנה את השערים במידת הצורך. כדי להציג באופן חזותי את התוצאות שהושגו על-ידי ניתוח זה, לחץ על עורך הפריסה במקטע רצועת הכלים של סביבת העבודה כדי לפתוח אותו. גרור כל שער של אסטרטגיית הג’יטינג בחלונית לדוגמה לעורך הפריסה, והצב את התוויות בהתאם לרצף אסטרטגיית הג’יטינג. במידת הצורך, שנה את סוג התרשים על-ידי לחיצה כפולה על התוויית התוויה המתאימה בפריסה ובחירת הסוג המתאים בחלון הגדרת גרף. לחץ על הקבוצה וחזר לפי פונקציות ברצועת הכלים לפריסה כדי לדמיין את התוצאות המתקבלות בכל איבר, ולהשוות דוגמאות שונות.