Cocultura de Neurônios de Gânglio Axotomizado de Rato Retinal com Glia Ensheathing Olfactory, como um Modelo In Vitro de Regeneração Axonal Adulta

Os neurônios do sistema nervoso central adulto (SNC) têm capacidade regenerativa limitada após lesão ou doença. Uma estratégia comum para promover a regeneração do SNC é o transplante, no local da lesão, de tipos celulares que induzem o crescimento axonal, como células-tronco, células schwann, astrócitos ou células ensheathing glia (OEG)^1,2,3,4,5.

OEG deriva da crista neural⁶ e se localiza na mucosa olfativa e na lâmpada olfativa. No adulto, neurônios sensoriais olfativos morrem regularmente como resultado da exposição ambiental e são substituídos por neurônios recém-diferenciados. O OEG circunda e guia esses novos axônios olfativos para entrar na lâmpada olfativa e estabelecer novas sinapses com seus alvos no CNS⁷. Devido a esses atributos fisiológicos, o OEG tem sido utilizado em modelos de lesão de SNC, como lesão medular ou nervo óptico e suas propriedades neurorregenerativas e neuroprotetoras se tornam^{comprovadas 8,9,10,11}. Vários fatores foram identificados como responsáveis pelas características pró-regenerativas dessas células, incluindo a produção ou secreção de proteases de matriz extracelular ou secreção dos fatores de crescimento neurotrófico e axonal^12,13,14.

Dadas as limitações técnicas para expandir as células primárias de OEG, estabelecemos e caracterizamos linhas clonais de OEG humano igênitas reversíveis (ihOEG), que fornecem um fornecimento ilimitado de OEG homogêneo. Estas células ihOEG derivam de culturas primárias, preparadas a partir de lâmpadas olfativas obtidas em autópsias. Eles foram imortalizados pela transdução da subunidade catalítica telomerase (TERT) e do oncogene Bmi-1 e modificados com o vírus SV40 grande antígeno T^15,16,17,18. Duas dessas linhas celulares ihOEG são Ts14, que mantém a capacidade regenerativa das culturas originais e Ts12, uma linha regenerativa baixa que é usada como baixo controle de regeneração nesses experimentos¹⁸.

Para avaliar a capacidade de OEG para promover a regeneração axonal após lesão neural, vários modelos in vitro foram implementados. Nesses modelos, o OEG é aplicado a culturas de diferentes origens neuronais e formação de neurita e alongamento — em resposta à cocultura gliana — são avaliados. Exemplos dessas fontes neuronais são neurônios corticais neonatais de ratos¹⁹, feridas de arranhão realizadas em neurônios embrionários de ratos de tecido cortical²⁰, explanações de retina de rato^21,neurônios hipotalâmicos ou hipocampais^22,23, neurônios gânglios de raiz dorsal de rato pós-natal²⁴, neurônios do trato corticospinal do camundongo pós-natal²⁵, neurônios NT2 humanos²⁶, ou neurônios corticais cerebrais pós-natal em culturas de cicatriz de astrócito reativas²⁷.

Nesses modelos, no entanto, o ensaio de regeneração conta com neurônios embrionários ou pós-natais, que têm uma plasticidade intrínseca que está ausente em neurônios adultos feridos. Para superar essa desvantagem, apresentamos um modelo de regeneração axonal adulta em coculturas de linhas de OEG com neurônios gânglios de retina adulta (RGNs), baseado no originalmente desenvolvido por Wigley et al.^28,29,30,31 e modificados e usados pelo nosso grupo^{12,13,14,15,16,17,18,32,33}. Resumidamente, o tecido retiniano é extraído de ratos adultos e digerido com papain. A suspensão das células de retina é então banhada em deslizamentos tratados com polilise ou em monocamadas Ts14 e Ts12. As culturas são mantidas por 96 h antes de serem fixadas e, em seguida, a imunofluorescência para proteínas axona (MAP1B e NF-H)³⁴ e somatodendritic (MAP2A e B)³⁵ marcadores são realizados. A regeneração axonal é quantificada como uma porcentagem de neurônios com axônio, em relação à população total de RGNs e o índice de regeneração axonal é calculado como o comprimento axonal médio por neurônio. Este protocolo não é apenas útil para avaliar o potencial neuroregenerativo do IhOEG, mas pode ser estendido a diferentes fontes de OEG ou outras células gliais.