Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

I neuroni del sistema nervoso centrale adulto (SNC) hanno una capacità rigenerativa limitata dopo lesioni o malattie. Una strategia comune per promuovere la rigenerazione del SNC è il trapianto, nel sito delle lesioni, di tipi cellulari che inducono la crescita assonale come cellule staminali, cellule di Schwann, astrociti o cellule olfattive glia (OEG)^1,2,3,4,5.

OEG deriva dalla cresta neurale⁶ e si trova nella mucosa olfattiva e nel bulbo olfattivo. Nell’adulto, i neuroni sensoriali olfattivi muoiono regolarmente a causa dell’esposizione ambientale e vengono sostituiti da neuroni appena differenziati. OEG circonda e guida questi nuovi assoni olfattivi per entrare nel bulbo olfattivo e stabilire nuove sinapsi con i loro obiettivi nel CNS^7. A causa di questi attributi fisiologici, l’OEG è stato utilizzato in modelli di lesione del SNC come midollo spinale o lesione del nervo ottico e le sue proprietà neuroregenerative e neuroprotettive^{diventano dimostrate 8,9,10,11}. Diversi fattori sono stati identificati come responsabili delle caratteristiche pro-rigenerative di queste cellule, tra cui la produzione o la secrezione di fattori di crescita neurotrofica e assonale^12,13,14.

Date le limitazioni tecniche per espandere le cellule OEG primarie, abbiamo precedentemente stabilito e caratterizzato linee clonali OEG umane immortalate reversibili (ihOEG), che forniscono una fornitura illimitata di OEG omogeneo. Queste cellule ihOEG derivano da colture primarie, preparate da bulbi olfattivi ottenuti in autopsie. Sono stati immortalati per trasduzione della subunità catalitica telomerasi (TERT) e dell’oncogene Bmi-1 e modificati con il virus SV40 grande antigene T^15,16,17,18. Due di queste linee cellulari ihOEG sono Ts14, che mantiene la capacità rigenerativa delle colture originali e Ts12, una linea rigenerativa bassa che viene utilizzata come basso controllo di rigenerazione in questi esperimenti¹⁸.

Per valutare la capacità dell’OEG di favorire la rigenerazione assonale dopo la lesione neurale, sono stati implementati diversi modelli in vitro. In questi modelli, l’OEG viene applicato a colture di diversa origine neuronale e vengono saggiate la formazione e l’allungamento della neurite, in risposta alla cocoltura gliale. Esempi di tali fonti neuronali sono i neuroni corticali del ratto neonatale¹⁹, le ferite da graffio eseguite sui neuroni embrionali del ratto dal tessuto^{corticale 20,}le espianto retiniche^{del ratto 21}, i neuroni postnatali ipotalamici o ippocampali del ratto^22,23, neuroni ganglionali della radice dorsale del ratto postnatale²⁴, neuroni del tratto corticospinale del topo postnatale^25,neuroni NT2^{umani 26}o neuroni corticali cerebrali postnatali su colture reattive simili a cicatrici astrociti²⁷.

In questi modelli, tuttavia, il test di rigenerazione si basa su neuroni embrionali o postnatali, che hanno una plasticità intrinseca che è assente nei neuroni adulti feriti. Per superare questo inconveniente, presentiamo un modello di rigenerazione assonale adulta in coculture di linee OEG con neuroni ganglionali retini adulti (RGN), basato su quello originariamente sviluppatoda Wigley et^al. In breve, il tessuto retinale viene estratto da ratti adulti e digerito con papaina. La sospensione cellulare retinica viene quindi placcata su coverlips trattate con polilisina o su monostrati Ts14 e Ts12. Le colture vengono mantenute per 96 ore prima di essere fissate e quindi viene eseguita l’immunofluorescenza per i marcatori assonale (proteine MAP1B e NF-H)³⁴ e somatodendritica (MAP2A e B)³⁵ marcatori. La rigenerazione assonale è quantificata come percentuale di neuroni con assone, rispetto alla popolazione totale di RGN e l’indice di rigenerazione assonale è calcolato come lunghezza assonale media per neurone. Questo protocollo non è solo utile per valutare il potenziale neuroregenerativo di ihOEG, ma può essere esteso a diverse fonti di OEG o altre cellule gliali.