Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie
Summary
We presenteren een in vitro model om olfactorisch verwarmend glia (OEG) neuroregeneratief vermogen te beoordelen, na neuraal letsel. Het is gebaseerd op een cocultuur van axotomized volwassen retinale ganglion neuronen (RGN) op OEG monolagen en daaropvolgende studie van axonale regeneratie, door het analyseren van RGN axonale en somatodendritische markers.
Abstract
Olfactorische ensheathing glia (OEG) cellen zijn gelokaliseerd helemaal van het reukslijmvlies tot en in de reukzenuwlaag (ONL) van de reukbol. Gedurende het hele volwassen leven zijn ze de sleutel tot de axonale groei van nieuw gegenereerde reukneuronen, van de lamina propria tot het ONL. Vanwege hun pro-regeneratieve eigenschappen zijn deze cellen gebruikt om axonale regeneratie in ruggenmerg- of oogzenuwletselmodellen te bevorderen.
We presenteren een in vitro model om OEG neuroregeneratieve capaciteit na neurale verwonding te testen en te meten. In dit model wordt reversibel vereeuwigd menselijk OEG (ihOEG) gekweekt als een monolaag, netvliezen worden geëxtraheerd uit volwassen ratten en retinale ganglionneuronen (RGN) worden samengecultiveerd op de OEG-monolaag. Na 96 uur worden axonale en somatodendritische markers in RGN’s geanalyseerd door immunofluorescentie en wordt het aantal RGN’s met axon en de gemiddelde axonlengte/neuron gekwantificeerd.
Dit protocol heeft het voordeel ten opzichte van andere in vitro tests die afhankelijk zijn van embryonale of postnatale neuronen, dat het OEG neuroregeneratieve eigenschappen in volwassen weefsel evalueert. Het is ook niet alleen nuttig voor het beoordelen van het neuroregeneratieve potentieel van ihOEG, maar kan worden uitgebreid naar verschillende bronnen van OEG of andere gliacellen.
Introduction
Volwassen centrale zenuwstelsel (CZS) neuronen hebben beperkte regeneratieve capaciteit na letsel of ziekte. Een gemeenschappelijke strategie ter bevordering van CZS-regeneratie is transplantatie, op de plaats van verwonding, van celtypen die axonale groei induceren, zoals stamcellen, Schwann-cellen, astrocyten of reukverwarmende gliacellen (OEG)1,2,3,4,5.
OEG is afgeleid van de neurale top6 en bevindt zich in het reukslijmvlies en in de reukbol. Bij volwassenen sterven reuksensorische neuronen regelmatig als gevolg van blootstelling aan het milieu en worden ze vervangen door nieuw gedifferentieerde neuronen. OEG omringt en begeleidt deze nieuwe reuk-axonen om de reukbol in te voeren en nieuwe synapsen met hun doelen in de CNS7vast te stellen. Vanwege deze fysiologische eigenschappen is OEG gebruikt in modellen van CZS-letsel zoals ruggenmerg- of oogzenuwletsel en zijn neuroregeneratieve en neuroprotectieve eigenschappen worden bewezen8,9,10,11. Verschillende factoren zijn geïdentificeerd als verantwoordelijk voor de pro-regeneratieve kenmerken van deze cellen, waaronder extracellulaire matrix proteasenproductie of afscheiding van neurotrofe en axonale groeifactoren12,13,14.
Gezien de technische beperkingen om primaire OEG-cellen uit te breiden, hebben we eerder omkeerbare vereeuwigde menselijke OEG (ihOEG) clonale lijnen opgericht en gekenmerkt, die een onbeperkte toevoer van homogene OEG bieden. Deze ihOEG-cellen zijn afkomstig van primaire culturen, bereid uit reukbollen verkregen in autopsies. Ze werden vereeuwigd door transductie van de telomerase katalytische subeenheid (TERT) en de oncogene Bmi-1 en gewijzigd met het SV40-virus groot T-antigeen15,16,17,18. Twee van deze ihOEG-cellijnen zijn Ts14, die de regeneratieve capaciteit van de oorspronkelijke culturen behoudt en Ts12, een lage regeneratieve lijn die wordt gebruikt als een lage regeneratiecontrole in deze experimenten18.
Om het OEG-vermogen te beoordelen om axonale regeneratie na neurale verwonding te bevorderen, zijn verschillende in vitro modellen geïmplementeerd. In deze modellen wordt OEG toegepast op culturen van verschillende neuronale oorsprong en worden neurietvorming en rek – als reactie op glia-cocultuur – getest. Voorbeelden van dergelijke neuronale bronnen zijn neonatale rat corticale neuronen19, kraswonden uitgevoerd op rat embryonale neuronen uit corticale weefsel20, rat retinale explants21, rat hypothalamus of hippocampale postnatale neuronen22,23, postnatale rat dorsale wortel ganglion neuronen24,postnatale muis corticospinale tractus neuronen25, menselijke NT2 neuronen26, of postnatale cerebrale corticale neuronen op reactieve astrocyte litteken-achtige culturen27.
In deze modellen is de regeneratietest echter gebaseerd op embryonale of postnatale neuronen, die een intrinsieke plasticiteit hebben die afwezig is bij gewonde volwassen neuronen. Om dit nadeel te overwinnen, presenteren we een model van volwassen axonale regeneratie in coculturen van OEG-lijnen met volwassen retinale ganglionneuronen (RGNs), gebaseerd op het model oorspronkelijk ontwikkeld door Wigley et al.28,29,30,31 en gewijzigd en gebruikt door onze groep12,13,14,15,16,17,18,32,33. Kortom, netvliesweefsel wordt geëxtraheerd uit volwassen ratten en verteerd met papaïne. Retinale celsuspensie wordt vervolgens geplateerd op met polylysine behandelde coverslips of op Ts14- en Ts12-monolagen. Culturen worden gedurende 96 uur bewaard voordat ze worden gefixeerd en vervolgens wordt immunofluorescentie uitgevoerd voor axonale (MAP1B- en NF-H-eiwitten)34 en somatodendritische (MAP2A en B)35 markers. Axonale regeneratie wordt gekwantificeerd als een percentage neuronen met axon, met betrekking tot de totale populatie RGN’s en de axonale regeneratie-index wordt berekend als de gemiddelde axonale lengte per neuron. Dit protocol is niet alleen nuttig voor het beoordelen van het neuroregeneratieve potentieel van ihOEG, maar kan worden uitgebreid naar verschillende bronnen van OEG of andere gliacellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
OEG-transplantatie op CZS-letselplaatsen wordt beschouwd als een veelbelovende therapie voor CZS-letsel vanwege de constitutieve pro-neuroregeneratieve eigenschappen7,8,9. Afhankelijk van de weefselbron — reukslijmvlies (OM-OEG) versus reukbol (OB-OEG)— of de leeftijd van de donor bestaat er echter aanzienlijke variatie in dergelijke capaciteit26,31,<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd financieel ondersteund door project SAF2017-82736-C2-1-R van Ministerio de Ciencia e Innovación tot MTM-F en door Fundación Universidad Francisco de Vitoria aan JS.
Materials
| antibody 514 | Reference 34 | Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B. | |
| antibody SMI-31 | BioLegend | 801601 | Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins |
| anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibody | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | NMDA receptor inhibitor |
| DAPI | Sigma | D9542 | Nuclei fluorescent stain |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Cell culture medium |
| FBS | Gibco | 11573397 | Fetal bovine serum |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Fetal bovine serum |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Mounting medium |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Image software | |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605F | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Neuronal cells culture medium |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | For use in neural cell isolation |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Lonza | 17-745E | Bacteriostatic and bactericidal |
| Pituitary extract | Gibco | 13028014 | Bovine pituitary extract |
| Poly -L- lysine (PLL) | Sigma | A-003-M |
References
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nature Neuroscience. 20 (5), 637-647 (2017).
- Lindsay, S. L., Toft, A., Griffin, J., Emraja, A. M. M., Barnett, S. C., Riddell, J. S. Human olfactory mesenchymal stromal cell transplants promote remyelination and earlier improvement in gait coordination after spinal cord injury. Glia. 65 (4), 639-656 (2017).
- Moreno-Flores, M. T., et al. A clonal cell line from immortalized olfactory ensheathing glia promotes functional recovery in the injured spinal cord. Molecular Therapy. 13 (3), 598-608 (2006).
- Gilmour, A. D., Reshamwala, R., Wright, A. A., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Optimizing olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord injury repair. Journal of Neurotrauma. 37 (5), 817-829 (2020).
- Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21040-21045 (2010).
- Su, Z., He, C. Olfactory ensheathing cells: biology in neural development and regeneration. Progress in Neurobiology. 92 (4), 517-532 (2010).
- Yao, R., et al. Olfactory ensheathing cells for spinal cord injury: sniffing out the issues. Cell Transplant. 27 (6), 879-889 (2018).
- Gómez, R. M., et al. Cell therapy for spinal cord injury with olfactory ensheathing glia cells (OECs). Glia. 66 (7), 1267-1301 (2018).
- Plant, G. W., Harvey, A. R., Leaver, S. G., Lee, S. V. Olfactory ensheathing glia: repairing injury to the mammalian visual system. Experimental Neurology. 229 (1), 99-108 (2011).
- Xue, L., et al. Transplanted olfactory ensheathing cells restore retinal function in a rat model of light-induced retinal damage by inhibiting oxidative stress. Oncotarget. 8 (54), 93087-93102 (2017).
- Pastrana, E., et al. Genes associated with adult axon regeneration promoted by olfactory ensheathing cells: a new role for matrix metalloproteinase 2. The Journal of Neuroscience. 26, 5347-5359 (2006).
- Pastrana, E., et al. BDNF production by olfactory ensheathing cells contributes to axonal regeneration of cultured adult CNS neurons. Neurochemistry International. 50, 491-498 (2007).
- Simón, D., et al. Expression of plasminogen activator inhibitor-1 by olfactory ensheathing glia promotes axonal regeneration. Glia. 59, 1458-1471 (2011).
- Lim, F., et al. Reversibly immortalized human olfactory ensheathing glia from an elderly donor maintain neuroregenerative capacity. Glia. 58, 546-558 (2010).
- García-Escudero, V., et al. Prevention of senescence progression in reversibly immortalized human ensheathing glia permits their survival after deimmortalization. Molecular Therapy. 18, 394-403 (2010).
- García-Escudero, V., et al. A neuroregenerative human ensheathing glia cell line with conditional rapid growth. Cell Transplant. 20, 153-166 (2011).
- Plaza, N., Simón, D., Sierra, J., Moreno-Flores, M. T. Transduction of an immortalized olfactory ensheathing glia cell line with the green fluorescent protein (GFP) gene: Evaluation of its neuroregenerative capacity as a proof of concept. Neuroscience Letters. 612, 25-31 (2016).
- Deumens, R., et al. Alignment of glial cells stimulates directional neurite growth of CNS neurons in vitro. Neuroscience. 125 (3), 591-604 (2004).
- Chung, R. S., et al. Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors. Cell and Molecular Life Sciences. 61 (10), 1238-1245 (2004).
- Leaver, S. G., Harvey, A. R., Plant, G. W. Adult olfactory ensheathing glia promote the long-distance growth of adult retinal ganglion cell neurites in vitro. Glia. 53 (5), 467-476 (2006).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells exert a trophic effect on the hypothalamic neurons in vitro. Neuroscience Letters. 417 (1), 24-29 (2007).
- Pellitteri, R., Spatuzza, M., Russo, A., Zaccheo, D., Stanzani, S. Olfactory ensheathing cells represent an optimal substrate for hippocampal neurons: an in vitro study. International Journal of Developmental Neuroscience. 27 (5), 453-458 (2009).
- Runyan, S. A., Phelps, P. E. Mouse olfactory ensheathing glia enhance axon outgrowth on a myelin substrate in vitro. Experimental Neurology. 216 (1), 95-104 (2009).
- Witheford, M., Westendorf, K., Roskams, A. J. Olfactory ensheathing cells promote corticospinal axonal outgrowth by a L1 CAM-dependent mechanism. Glia. 61 (11), 1873-1889 (2013).
- Roloff, F., Ziege, S., Baumgärtner, W., Wewetzer, K., Bicker, G. Schwann cell-free adult canine olfactory ensheathing cell preparations from olfactory bulb and mucosa display differential migratory and neurite growth-promoting properties in vitro. BMC Neuroscience. 14, 141 (2013).
- Khankan, R. R., Wanner, I. B., Phelps, P. E. Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures. Experimental Neurology. 269, 93-101 (2015).
- Wigley, C. B., Berry, M. Regeneration of adult rat retinal ganglion cell processes in monolayer culture: comparisons between cultures of adult and neonatal neurons. Brain Research. 470 (1), 85-98 (1988).
- Sonigra, R. J., Brighton, P. C., Jacoby, J., Hall, S., Wigley, C. B. Adult rat olfactory nerve ensheathing cells are effective promoters of adult central nervous system neurite outgrowth in coculture. Glia. 25 (3), 256-269 (1999).
- Hayat, S., Thomas, A., Afshar, F., Sonigra, R., Wigley, C. B. Manipulation of olfactory ensheathing cell signaling mechanisms: effects on their support for neurite regrowth from adult CNS neurons in coculture. Glia. 44 (3), 232-241 (2003).
- Kumar, R., Hayat, S., Felts, P., Bunting, S., Wigley, C. Functional differences and interactions between phenotypic subpopulations of olfactory ensheathing cells in promoting CNS axonal regeneration. Glia. 50 (1), 12-20 (2005).
- Moreno-Flores, M. T., Lim, F., Martín-Bermejo, M. J., Díaz-Nido, J., Avila, J., Wandosell, F. Immortalized olfactory ensheathing glia promote axonal regeneration of rat retinal ganglion neurons. Journal of Neurochemistry. 85 (4), 861-871 (2003).
- García-Escudero, V., et al. Patient-derived olfactory mucosa cells but not lung or skin fibroblasts mediate axonal regeneration of retinal ganglion neurons. Neuroscience Letters. 509 (1), 27-32 (2012).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (19), 6126-6130 (1983).
- Sánchez Martin, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Regulation of a site-specific phosphorylation of the microtubule-associated protein 2 during the development of cultured neurons. Neuroscience. 87 (4), 861-870 (1998).
- Reshamwala, R., Shah, M., Belt, L., Ekberg, J. A. K., St. John, J. A. Reliable cell purification and determination of cell purity: crucial aspects of olfactory ensheathing cell transplantation for spinal cord repair. Neural Regeneration Research. 15 (11), 2016-2026 (2020).
