Nötron Spin Yankı Spektroskopisi ile Protein Dinamiğinin İncelenmesi

Yumuşak maddenin nötronlarla sondalama dinamikleri
Proteinlerin ve peptitlerin dinamik özelliklerini araştırmak, biyofiziksel araştırmanın önemli bir parçasıdır ve günümüzde çok çeşitli enerji manzaralarına erişmek için birçok iyi geliştirilmiş yöntem^{bulunmaktadır 1}. Proteinlerin deneysel olarak ortaya çıkan dinamiklerini biyolojik işlevleriyle ilişkilendirmek, karmaşık matematiksel modeller ve bilgisayar destekli dinamik simülasyonları gerektiren çok daha zor bir iştir. Protein hareketlerinin analizi için nötron spektroskopisinin önemi, iyi karşılanan ve yaygın olarak tanınan birkaç çalışmada vurgulanmıştır ^1,2,3,4,5. İç protein dinamiklerinin çeşitli enerji manzarasını keşfetmeden önce, yumuşak maddedeki dinamik süreçlere ve nötronların bunlara nasıl erişebileceğine dair kısa bir genel bakış gereklidir.

Nötronların izotopik konfigürasyona duyarlılığı ve yumuşak madde ile gösterdikleri etkileşimlerin türü, nötron saçılımını en çok yönlü araştırma tekniklerinden biri haline getirir⁶. Nötronların erişebileceği geniş bir korelasyon uzunluğu ölçekleri ve korelasyon süreleri spektrumu vardır, nükleer uyarımlardan ve atomik titreşimlerden kolektif hareketlere ve izotropik rotasyonlar ve difüzif hareketler gibi yavaş gevşeme süreçlerine kadar. Dağınık nötronları enerji transferleri için araştırırken, üç ana etkileşim ayırt edilebilir: numunede gelen nötron ve parçacık arasında enerji alışverişinin olmadığı elastik saçılma; nötron ve parçacık arasında büyük, ölçülebilir bir enerji değişimi ile elastik olmayan saçılma; ve olay nötron enerjisine kıyasla çok küçük bir enerji transferini gösteren tuhaf yarı-elastik saçılma durumu ^1,7. Bu etkileşimler, araştırılan malzeme hakkında kesin bilgi verir ve çok çeşitli nötron saçılma tekniklerinin teorik temelini oluşturur.

Elastik saçılmada, dedektör nötronların yönlerini, örnek atomların birbirlerine göre konumunu gösteren bir kırınım paterni olarak kaydeder. Atomik konumların korelasyonları hakkında bilgi edinilir (yani, yalnızca yapısal bilgiyle ilgili olan momentum transferi Q ile ilgili entegre yoğunluk S ( Q). Bu ilke nötron kırınımının temelini oluşturur⁸.

Karmaşıklık, numune malzemesindeki uyarılmalar ve iç dalgalanmalar nedeniyle enerji transferi artık sıfır olmadığında ortaya çıkar. Bu, dağınık nötronların hem enerji transferi E hem de momentum transferi Q’nun bir fonksiyonu olarak araştırıldığı nötron spektroskopisinin temelini oluşturur. Dinamik ve yapısal bilgiler elde edilir. Nötron spektroskopisi, enerji transferi için aynı entegre yoğunluk S(Q)’yu ölçer (yani, numune saçılması nedeniyle nötronların hız değişimi, S(Q,ω) = S(Q, E), dinamik yapı faktörü olarak da adlandırılır)⁹.

Bir malzemeden saçılımı hesaplamak için, ^7,10 çift korelasyon fonksiyonunu kullanmak daha yeterlidir. Kırınım durumunda, statik çift korelasyon fonksiyonu G(r), bir parçacığın merkezini başka bir parçacığın merkezinden belirli bir mesafe r’de bulma olasılığını verir. Spektroskopi, statik çift korelasyon fonksiyonunu genelleştirir ve saçılma denklemine enerji / frekans / zaman içerir. Çift korelasyon fonksiyonu G(r), ayrı bir atom çifti korelasyon fonksiyonu G _D(r, t) ve bir öz-korelasyon fonksiyonu G _S(r, t) olarak ayrıştırılabilen G(r, t) zamanının bir fonksiyonu haline gelir. Bunlar iki tür korelasyonu tanımlar: tutarlı saçılımı yöneten atomların çift korelasyonlu hareketleri ve tutarsız saçılımı yöneten kendi kendine korelasyon¹⁰.

Tutarlı saçılma, “ortalama” dan saçılmadır ve dağınık dalgaların göreceli fazına bağlıdır. Küçük açılı saçılma rejiminde, farklı saçılma merkezlerinden (farklı atomlar) gelen saçılan nötron dalgaları yapıcı bir şekilde müdahale eder (benzer fazlara sahiptir) ve atomların kolektif hareketi güçlü yoğunluk artışı ile gözlenir. Tutarlı saçılma esas olarak örnek^10’daki tüm çekirdeklerden tek bir nötronun saçılmasını tanımlar.

Farklı merkezlerden gelen dağınık nötron dalgaları arasında yapıcı bir girişim meydana gelmediğinde, zaman içinde tek bir atom takip edilir ve atomun t = 0 zamanındaki konumu ile t zamanındaki aynı atom arasındaki öz korelasyon gözlenir. Böylece, atomların göreceli konumları hakkındaki bilgiler kaybolur ve odak noktası sadece yerel dalgalanmalardır. Yerel dalgalanmalardan kaynaklanan saçılma, tutarsız saçılımı yönetir. Tutarsız saçılma izotropiktir, arka plan sinyaline katkıda bulunur ve sinyalden gürültüye ^10,11’i bozar.

Yukarıdakilerin hepsini birleştirerek, dört ana nötron saçılma işlemini ayırt ediyoruz¹⁰: (1) elastik tutarlı (atomik konumların korelasyonlarını ölçer), (2) elastik olmayan tutarlı (atomların kolektif hareketlerini ölçer), (3) elastik tutarsız (arka plana katkıda bulunur, Debye-Waller faktörü (DWF) ile saçılma yoğunluğunu azaltır ve sınırlı geometrideki difüzyon hareketlerinin geometrisini tanımlayan elastik tutarsız yapı faktörünü (EISF) ölçer, ve (4) elastik tutarsız (tek atom dinamiklerini ve kendi kendine korelasyonu ölçer).

Nötronların biyolojide erişebileceği dinamik süreçler, düşük frekanslı atomik ve moleküler titreşimlerin sönümlenmesinden, çözücü moleküllerinin biyo-yüzeylerle etkileşiminden ve makromoleküllerin hidrasyon tabakasındaki difüzyon işlemlerinden ve sınırlı geometriden, kısa menzilli translasyonel, rotasyonel ve yuvarlanan difüzyon hareketlerine ve protein alanlarına ve allosterik hareketlere kadar^uzanır1 . Protein dinamiklerini ölçmek için nötron yöntemlerinin ve araçlarının geniş çeşitliliği, olayın veya giden nötron ışınının akromatizasyonunun nasıl elde edildiğine ve dağınık nötronların enerji analizinin nasıl yapıldığına dayanmaktadır. Üç eksenden uçuş zamanına, geri saçılmaya ve spin-echo spektrometrelerine kadar, 1 x 10-14 s ile 1 x ^10-6 s (femtosaniyelerden mikrosaniyelere)¹² arasındaki karakteristik sürelere sahip dinamik süreçler keşfedilebilir.

Oak Ridge Ulusal Laboratuvarı, iki ünlü nötron kaynağı olan Spallation Neutron Source – SNS¹³ ve High Isotop Flux Reactor – HFIR¹⁴ ile, biyo-malzemelerdeki dinamikleri araştırmak için en iyi spektrometre paketlerinden birine sahiptir. En anlamlı örneklerden bazıları, SNS^15’teki soğuk nötron kıyıcı spektrometresinin (CNCS), çözelti^16’daki yeşil floresan proteini etrafındaki hidrasyon suyunun dinamik pertürbasyonunu veya birkaç proteinin pikosaniye altı kolektif titreşimlerini araştırmak için kullanılmasıdır¹⁷. Elastik olmayan nötron saçılma araştırmalarının tekrarlayan bir problemi, bazı biyolojik süreçlerin gözlemlenemeyecek kadar yavaş olmasıdır. Büyük bir nötron yoğunluğu kaybına yol açan aşırı kurulumlar olmadan, uçuş süresi spektrometreleri, ~ 200 ps 10,11’lik maksimum zaman ölçeğine karşılık gelen¹⁰ μeV enerji çözünürlüğü ile ^{sınırlıdır.} Bu, proteinlerdeki büyük ölçekli hareketleri gözlemlemek için yeterli değildir. Bu nedenle, geri saçılma spektrometreleri gibi daha yüksek enerji çözünürlüğüne sahip cihazlara sıklıkla ihtiyaç duyulur. Uçuş süresi ve geri saçılma tekniklerini birleştirmek, hidroksilasyon kafuru^18’i katalize eden bir enzim olan Sitokrom P450cam’ın (CYP101) iç dinamiklerindeki değişimi araştırmak için güçlü olduğunu kanıtlamıştır.

SNS-BASIS^19’daki geri saçılma spektrometresi tarafından ölçülen mikroskobik difüzyon şaşırtıcı derecede iyi tanımlanmıştır ve suyun difüzyonuna (hidrasyon, sitoplazmik ve toplu benzeri su) ve nötron saçılması ile incelenen ilk canlı hayvan olan planarian yassı solucanlardaki hücre bileşenlerinin difüzyonuna ayrılabilir²⁰ . Geri saçılma yüksek çözünürlüklü spektroskopik bir tekniktir, ancak aynı zamanda birkaç μeV = birkaç nanosaniye ile sınırlıdır, biyomalzemelerdeki yavaş dinamikler aynı zamanda atomik konum veya spin oryantasyonları arasındaki korelasyonun hayatta kalma süresi olarak da kendini gösterir (örneğin, on ila yüzlerce nanosaniye zaman aralığında düzenli olarak gerçekleşen gevşeme süreçleri).

Nötron spin eko spektroskopisi (NSE), bu kadar yüksek çözünürlüğe ulaşan tek nötron saçılma tekniğidir. Diğer nötron tekniklerinin aksine, NSE, nötronların manyetik momentleri olan kuantum mekanik fazını kullandığı için ışının akromatizasyonunu gerektirmez. Manyetik momentlerin manipülasyonu, geniş bir nötron ışını dalga boyu dağılımının kullanılmasına izin verirken, teknik 1 x ^10-4 sırasına göre çok küçük nötron hızı değişikliklerine duyarlıdır. NSE, birçok protein için çözeltideki proteinlerin yavaş dinamiklerini araştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Bu birçok öncü çalışma arasında, domuz immünoglobulin^21’in segmental esnekliğinin incelenmesini kabul ediyoruz; Taq polimeraz^22’deki birleştirilmiş alan hareketleri; maya alkol dehidrogenaz^23’ün tetramerindeki etki alanı hareketleri; substrat bağlanması üzerine fosfogliserat kinazdaki konformasyonun değişmesi³; alan hareketlerinin aktivasyonu ve Na+/H⁺ değişim düzenleyici kofaktör 1 (NHERF1) proteini^{4,24,25’teki} allosterik sinyallerin dinamik yayılımı; merkürik iyon redüktaz^26’nın kompakt bir durumunun dinamiği; ve hemoglobinin kırmızı kan hücrelerinde difüzyonu²⁷. Protein dinamiği üzerine yapılan iki yeni çalışma, insan antikoru İmmünoglobulin G’nin (IgG) entropik bir yay²⁸ olarak esnekliğini ve çözücünün içsel olarak bozulmuş miyelin bazik proteininin (MBP) dinamiklerine katkısının özelliklerini ortaya ^koymuştur5.

Bu makalede, NSE’nin temel ilkeleri, kapsamlı bir protein dinamiği araştırması için önerilen çoklu hazırlık yöntemleri ve ayrıca SNS, SNS-NSE’deki NSE spektrometresinde NSE veri toplama metodolojisi ve deneysel protokolü açıklanmaktadır. Protokol iki proteini karakterize eder: IgG, normal bir insan antikor proteini ve özünde düzensiz protein MBP. Biyofiziksel etkileri, örneklerin araştırma ile ilgisi ve tekniğin sınırlamaları kısaca tartışılmıştır.

NSE spektroskopisi, yavaş dinamik ölçümleri için yöntem
NSE, bir numunedeki nötronlar ve atomlar arasındaki yarı-elastik etkileşim nedeniyle enerji değişimini (polarizasyon kaybı) ölçmek için nötron uçuş süresini kullanan polarize bir tekniktir. NSE spektroskopisinin özünde iki temel ilke yatmaktadır: (1) nötron spininin manyetik alanda manyetik kuvvetle orantılı bir frekansla presese kabiliyeti, yani Larmor frekansı²⁹ ve (b) bir dizi radyofrekans darbesi uygulanırken polarizasyon sinyalinin manipülasyonunu ve yeniden odaklanmasını temsil eden spin-echo veya Hann echo³⁰.

NSE sürecinin temelleri, Şekil 1 kullanılarak birkaç basit adımda ^6,11 olarak özetlenebilir. (1) Kaynak tarafından üretilen nötron ışını (konum 1) polarize edilir (konum 2), yönlendirilir ve taşınır (konum 3) ve NSE spektrometresinin girişine ulaşır, burada ilk pi-yarı palet (konum 4) tarafından 90 ° döndürülür. (2) Polarize ışın (örneğin, nötron manyetik momentleri) ilk mıknatısın manyetik alan çizgilerine (ilk presesyon bölgesi, pozisyon 5) dik hale gelir ve presese başlar. (3) Mıknatısın sonunda, nötron dönüşleri, manyetik alan kuvveti ve içeride harcanan uçuş süresi ile orantılı olarak belirli bir presesyon açısı biriktirir (temel olarak nötron hızıyla ters orantılıdır). Bireysel nötron hızları, ilk presesyon bölgesinin sonundaki presesyon açıları içinde kodlanır. (4) Numune konumuna yakın olan pi-palet (konum 6), presesyon açısının işaretini değiştirerek spinin yönünü 180 ° tersine çevirir. (5) Nötronlar numunenin molekülleriyle etkileşime girer (konum 7) ve dağılır. (6) Dağınık nötronlar ikinci presesyon bölgesine (pozisyon 8) girer ve presese girer, ancak ters yönelimli hale gelir. (7) Spin yönünü dikten yatay yöne döndürmek için başka bir pi-yarım palet (konum 9) kullanılır. Bu, presesyon açısını φ cos(φ) ile orantılı polarizasyona çevirerek presesyonu durduracaktır. (8) Analizör (konum 10) nötronları bir yöne göre seçer. Numune ile etkileşim elastik ise, nötronun hızı değişmeyecektir. Nötronlar, birinci ve ikinci presesyon bölgelerinde uçmak için aynı miktarda zaman harcayacak ve biriken presesyon açıları tamamen geri kazanılacaktır. Tam polarizasyon, dedektörde (pozisyon 11) orijinal polarizasyonun (yani spin-echo) bir yankısı olarak geri yüklenir. (9) Bununla birlikte, NSE’de saçılma yarı-elastiktir, bu nedenle nötronlar ve numune molekülleri arasındaki küçük bir enerji değişimi, numune tarafından saçıldıktan sonra farklı nötron hızlarına yol açar. Farklı hızlar nedeniyle, nötronlar ikinci presesyon bölgesinden uçmak için ek bir zaman harcayacak ve presesyon açılarını düzgün bir şekilde geri kazanamayacaktır. Dedektör üzerinde kısmi bir polarizasyon alınır ve spin gevşemesine bağlı polarizasyon kaybı, spektral fonksiyon S(Q, ω), ara saçılma fonksiyonu F(Q, t)’nin cos-Fourier dönüşümü ile orantılıdır. (10) F(Q, t) fonksiyonunun zaman parametresi, presesyon manyetik alan kuvveti ile orantılıdır. Polarizasyon kaybının manyetik alan kuvvetinin bir fonksiyonu olarak taranması, bu nedenle, numune içindeki dinamik süreçlere bağlı bir gevşeme fonksiyonu verir.

Resim 1: SNS’DE (SNS-NSE) NSE SPEKTROMETRESININ VE EN ÖNEMLI FONKSIYONEL BILEŞENLERLE NÖTRON SINEK YOLU ŞEMASıNıN FOTOĞRAFı. Sağdan sola: 1 = nötron kaynağı; 2 = doğrayıcılar-bükücü-polarizör-ikincil deklanşör sistemi; 3 = kiriş taşıma kılavuzları; İlk 90° spin-turn için 4 = pi/2 palet; 5 = ilk presesyon bölgesi; 6 = 180 ° spin-turn için pi flipper; 7 = numune alanı ve numune ortamı (burada, kriyo-fırın gösterilmiştir); 8 = ikinci presesyon bölgesi; İkinci 90° spin-turn için 9 = pi/2 palet; 10 = analizör; 11 = dedektör. (3’ün yanı sıra 2 ve 1’in bölümlerinin ekranlamanın içindeki mavi duvarın arkasında yer aldığını unutmayın; Kıyıcılar, reaktör tabanlı NSE için bir hız seçici ile değiştirilir). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.