PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Triptofan sintaz (TS) bienza kompleksi (α₂β_2),bakteri, bitki ve mantarlarda L-Triptofan amino asidinin biyosentezinde son iki adımı katalizleyen allosterik bir^enzimdir. Salmonella enterica serovar typhimurium (St) bakterisi insanlarda ve diğer hayvanlarda ciddi bir gastrointestinal enfeksiyona neden olur. İnsanlarda ve daha yüksek hayvanlarda TS (EC 4.2.1.20) olmadığından, S’nin inhibisyonu. tifüs α₂β₂ TS kompleksi (α₂β₂StTS) kriptosporidiosis ve tüberküloz tedavisi için potansiyel bir ilaç hedefi olarak araştırılmıştır⁴, genital ve oküler enfeksiyonlar⁵ve tarımda potansiyel herbisit kullanımı için⁶. α-alt birimi, GAP ve indole^3,6’yıüretmek için bir indolenine tautomer ara ve daha sonra karbon-karbon bağı bölünmesinin oluşumu yoluyla, gliseraldehit-3-fosfat (GAP) ve indole’ye kadar olan aldolitik bölünmeyi kataliz eder. β katalitik alan, β-Lys87’ye bir Schiff tabanı aracılığıyla bağlı bir piridoksial 5′-fosfat (PLP) kofaktör molekülü içerir, bu da enzim β-alt biradaki reaksiyonlar sırasında bir elektron lavabosu olarak işlev β^3,7. β alanı, L-Serine yan zincir hidroksilinin L-Triptofan ve PLP’ye bağımlı reaksiyonda bir su molekülü vermek için hintkenede değiştirilmesini katalİze eder. St TS, çok enzimli kompleksler içinde substrat kanal ve allosterik iletişimin araştırılması için uzun süredir devam eden bir model olarak hizmet vermektedir^2,3. L-Triptofan sentezi sırasında katalitik adımları senkronize etmek ve indole salınımını önlemek için TS’nin α ve β alt biraları arasındaki çift yönlü allosterik iletişim³. Bu çabayı genişletmek için, StTS β-subunit’in katalitik bölgesinde enzim yapısı, mekanizması ve fonksiyonu arasındaki ilişkinin daha fazla araştırılmasında kullanılmak üzere tek nokta mutasyonu ile birkaç mutant (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr ve β-Ser377Ala) hazırladık.

Edith W. Miles araştırma grubu tarafından_{α 2}β₂StTS’nin katalitik mekanizması hakkında detaylı araştırma başlatılmıştır. Yerli Escherichia coli α₂β₂ TS kompleksi ile yapılan ilk^{çalışmalar,}yalıtılmış α-alt bira 8 ,⁹, izole β-alt bira 10^,11ve α 2 β ₂TS kompleksinin yalıtılmış alt birelerden arındırılmasına ve karakterizasyonuna odaklanmıştır¹². Saflaştırma, amonyum sülfat çökeltme, örnek diyaliz, DEAE-Sephadex kromatografisi, diyaliz ve DEAE-Sephadex sütun¹²üzerinde ikinci bir kromatografik yuvarlak ile gerçekleştirildi. Başka bir protokolde, aynı kompleksin saflaştırılması, netleştirilmiş hücre lisatının bir DEAE-Sephadex sütununa yüklenmesi ve ardından Sepharose 4B sütununa kromatografik bir adım, amonyum sülfat çökeltme ve diyaliz¹³. Her iki saflaştırma protokolü de 4-5 gün sürer. Escherichia coli α₂β₂ TS kompleksi kristalize edildi, ancak kristaller o zaman X-ışını kırınımı için uygun değildi.

Yeni bir çalışmada, S. typhimurium α 2 β_2TS kompleksinin rekombinant ve vahşi tip formları saflaştırıldı ve kristalize edildi^14,15. Rekombinant α₂β₂StTS kompleksi, pEBA-10 ifade vektörü taşıyan E. coli strain CB149’da aşırı ifade edildi. α₂β 2StTS kompleksinin ilk kristalizasyonu ve_X-ışınıkırınım verisi toplanması ve analizi¹⁴bildirilmiştir. Bununla birlikte, α₂β₂StTS kristalleri gibi uzun ve ince iğne yapısal çalışmaları bozmuşlardır. Daha iyi X-ışını kırınım verileri toplamak amacıyla, α 2 β 2StTS kompleksi^15’invahşi tipini ve mutant formlarını arındırmak için başka bir saflaştırma protokolü tanımlanmıştır. Temizleme, netleştirilmiş hücre lisatına spermin ve PEG 8.000 kullanılarak ilk çökeltme ile gerçekleştirildi ve santrifüjleme ile büyük bir hacimli çökelti çıkarıldı. Yüksek miktarda α içeren süpernatant fraksiyon₂β₂StTS kompleksi, sarı kristaller çökene kadar 4 °C’de 16-48 saat boyunca depolandı. Kristaller yıkandı ve farklı tamponlara karşı yoğun bir şekilde çaprazlandı. Protein kompleksi amonyum sülfat içeren tamponda rekristalite edildi ve^15. Protein kristalizasyonu çözeltideki protein ve çökelti konsantrasyonlarına bağlı olsa da, çözeltideki diğer mutant formları için saflaştırmayı izlemek, tahmin etmek ve çoğaltmak α₂β₂StTS kompleksinin çözeltisinde. Bu protokol, herhangi bir kromatografik yöntem kullanmaması avantajına sahiptir; bununla birlikte, dezavantajları, tipik olarak 5-7 gün gerektiren kristalize etmek, dialyze etmek ve recrystallize etmek için gerekli olan uzun saflaştırma süresidir. X-ışını veri toplama için uygun kristaller elde etmek, 600’den fazla kristalizasyon koşulu protein konsantrasyonu, sıcaklık, çökeltiler (PEG 4.000, 6.000 ve 8.000) ve katkı maddeleri (CaCl 2 , MnCl₂, ZnCl₂, kadavra, putrescine, spermin veya spermidin) kombinasyonu ve varyasyonu kullanılarak değerlendirildi^15. Kristaller daha iyi bir kristal formuna sahipti ve% 12 PEG 8.000 ve 2 mM spermin içeren koşullarda daha hızlı büyüdü. Kristalizasyon 4, 30 veya 42 ° C yerine 25 ° C’de daha elverişliydi ve 3 gün içinde maksimum boyutlara büyüdü¹⁵. O dönemde(1996-β1999) 16 , 17 , 18 , 19,₂₀^,21ve daha birçok yapının yayınlandıkları α bildirilmiştir.

Burada temel amaç triptofan sintazını arındırmak ve protein kristalizasyonunu optimize etmek için alternatif protokoller sunmaktır. Mevcut çalışma, yalıtılmış β-alt birliğini (β St TS), 2 β 2StTS kompleksini yalıtılmış alt birelerden yeniden oluşturan αalt birliğini (α αStTS), α₂β₂StTS kompleksinin vahşi tip ve mutant formlarını arındırmak için önemli iyileştirmelergöstermektedir. Arınma süresi önemli ölçüde azaltıldığı ve kristalizasyon ve kriyoproteksiyon optimize edildiğinden, geçmiş protokollere göre avantajlar önemli ölçüdedir. Bu çalışmada tasarlanan α₂β₂StTS kompleksinin mutant formları, vahşi tip formu için kullanılan durumun yakınında kristalleşmiştir. Bununla birlikte, atomik çözünürlüğe yakın yapı belirleme için yeterli kalitede büyük tek kristaller elde etmek için ince kristalizasyon optimizasyonu gerekliydi. Bugüne kadar Protein Veri Bankası’nda (PDB) bakteri, arkea ve ökaryot için sırasıyla 101, 31 ve 2 kristal yapıyı oluşturan 134 triptofan sintaz kristal yapısı bulunmaktadır. Güzel bir şekilde, 73 yapı S. enterica serovar typhimurium’a aittir ve α 2 β₂StTS kompleksinin₅kristal yapısı 1.50 Angstrom’dan daha yüksek çözünürlük sınırlarına sahiptir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, araştırma grubumuzda 5’te 4’ü hazırlandı (PDB IDs:5CGQ 1.18 Å’da, 4HT3 1.30 Å’da, 4HPJ 1.45 Å’da, 6DZ4 1.45 şçözünürlükte). α₂β₂StTS kompleksinin mutant formunun rafine kristal yapılarının, L-Triptofan sentezinde yer alan esansiyel amino asit kalıntılarının oynadığı mekanizma ve roller hakkında yeni içgörüler sağlaması beklenmektedir.