Mutagénesis por PCR, clonación, expresión, protocolos rápidos de purificación de proteínas y cristalización del tipo salvaje y formas mutantes de triptófano sintasa

El complejo bienzimático triptófano sintasa (TS) (α₂β₂₎es una enzima alostérica, catalizando los dos últimos pasos en la biosíntesis del aminoácido L-triptófano en bacterias, plantas y hongos^1,2,3. La bacteria Salmonella enterica serovar typhimurium (St)causa una infección gastrointestinal grave en humanos y otros animales. Dado que los seres humanos y los animales superiores no tienen ST (EC 4.2.1.20), la inhibición de S. typhimurium α₂β₂ complejo TS (α₂β₂StTS) se ha explorado como un posible objetivo farmacológico para el tratamiento de la criptosporidiosis y la tuberculosis^4,las infecciones genitales y oculares^5,y para la posible utilización de herbicidas en la agricultura⁶. La α-subunidad cataliza la escisión aldolítica de indol-3-glicerol-fosfato (IGP) a gliceraldehído-3-fosfato (GAP) e indol, a través de la formación de un intermedio de tautómero de indolenina y posteriormente la escisión de enlaces carbono-carbono para producir GAP e indol^3,6. El sitio β-catalítico contiene una molécula de cofactor piridoxal 5′-fosfato (PLP) unida a β-Lys87 a través de una base de Schiff, que funciona como un sumidero de electrones en el curso de las reacciones en la enzima β-subunidad^3,7. El sitio β cataliza el reemplazo del hidroxilo de cadena lateral L-Serina por indol para dar L-triptófano y una molécula de agua en una reacción dependiente de PLP. Calle TS sirve como un modelo de larga data para la investigación de la canalización de sustratos y la comunicación alotérica dentro de complejos multienzimáticos^2,3. La comunicación alostérica bidireccional entre las subunidades α y β del ST es necesaria para sincronizar los pasos catalíticos y evitar la liberación de indol durante la síntesis de L-triptófano³. Para extender este esfuerzo, hemos preparado varios mutantes (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr y β-Ser377Ala) por mutación de punto único para ser utilizados en exploraciones adicionales de la relación entre la estructura enzimática, el mecanismo y la función en el sitio catalítico de la subunidad β StTS.

La investigación detallada sobre el mecanismo catalítico de α₂β₂StTS fue iniciada por el grupo de investigación de Edith W. Miles. Los primeros estudios con Escherichia coli nativa α_{complejo 2}β₂ TS se han centrado en la purificación y caracterización del complejo α-subunidad^8,9,aislado β-subunidad^10,11 y la reconstitución del complejo TS α₂β₂ a partir de las subunidades aisladas^12. La purificación se llevó a cabo mediante precipitación de sulfato de amonio, diálisis de muestras, cromatografía DEAE-Sephadex, diálisis y una segunda ronda cromatográfica en una columna¹²de DEAE-Sephadex. En otro protocolo, se mejoró la purificación del mismo complejo cargando el lisato celular clarificado en una columna DEAE-Sephadex seguido de un paso cromatográfico en una columna Sepharose 4B, precipitación de sulfato de amonio y diálisis¹³. Ambos protocolos de purificación duran de 4 a 5 días. Escherichia coli α_{complejo TS 2}β₂ cristalizados, pero los cristales no eran adecuados para la difracción de rayos X en ese momento.

En un estudio novedoso, las formas recombinantes y de tipo salvaje de S. typhimurium α_{complejo 2}β₂ TS fueron purificadas y cristalizadas^14,15. El complejo recombinante α₂β₂StTS se sobreexpresó en la cepa CB149 de E. coli que lleva el vector de expresión pEBA-10. Se reportó la recolección de datos de cristalización inicial y difracción de rayos X y el análisis del complejo stTS_α2 β₂¹⁴. Sin embargo, agujas largas y delgadas como α_{cristales de 2}β₂StTS deterioraron los estudios estructurales. En un intento de recopilar mejores datos de difracción de rayos X, se describió otro protocolo de purificación para purificar el tipo salvaje y las formas mutantes del complejo α₂β₂StTS^15. La purificación se llevó a cabo con una precipitación inicial utilizando esperfina y PEG 8.000 en el lisato celular clarificado y se eliminó un gran precipitado voluminoso por centrifugación. La fracción sobrenadante que contenía altas cantidades de α complejo StTS_{de 2}β₂se almacenó durante 16-48 h a 4 °C hasta que los cristales amarillos precipitaron. Los cristales fueron lavados y dializado extensamente contra diferentes tampones. El complejo proteico fue recristalizado en tampón que contenía sulfato de amonio y dializado¹⁵. Aunque la cristalización de proteínas depende de las concentraciones de proteínas y precipitantes en solución, es difícil monitorear, predecir y reproducir la purificación para otras formas mutantes de α_{complejo 2}β₂StTS en solución. Este protocolo tiene la ventaja de que no utiliza ningún método cromatográfico; sin embargo, las desventajas son el largo tiempo de purificación necesario para cristalizar, dializar y recristalizar, lo que generalmente requiere de 5 a 7 días. Para obtener cristales adecuados para la recolección de datos de rayos X, se evaluaron más de 600 condiciones de cristalización utilizando una combinación y variación de concentración de proteínas, temperatura, precipitantes (PEG 4,000, 6,000 y 8,000) y aditivos (CaCl_2,MnCl_2,ZnCl_2,cadaverina, putrescina, esperfina o espermidina)¹⁵. Los cristales tenían una mejor forma cristalina y crecían más rápido en condiciones que contenían 12% de PEG 8,000 y 2 mM de espermín. La cristalización fue más favorable a 25 ° C en lugar de a 4, 30 o 42 ° C y creció a dimensiones máximas dentro de los 3 días¹⁵. Varias α₂β₂estructuras cristalinasstTS fueron reportadas en ese momento (1996-1999)^{16,17,18,19,20,21} y muchas otras estructuras se han publicado hasta la fecha.

Aquí, el propósito principal es presentar protocolos alternativos para purificar la triptófano sintasa y optimizar la cristalización de proteínas. El presente trabajo muestra mejoras significativas para purificar el tipo salvaje aislado α-subunidad (αStTS), aislado β-subunidad (βStTS), reconstituido α_{complejo St 2}β₂StTS de las subunidades aisladas, y formas salvajes tipo y mutantes del complejo α₂β₂StTS. Las ventajas sobre los protocolos anteriores son considerables, ya que el tiempo de purificación se redujo significativamente y se optimizó la cristalización y la crioprotección. Las formas mutantes de α_{complejo 2}β₂StTS diseñado en este trabajo han cristalizado cerca de la misma condición utilizada para la forma de tipo salvaje. Sin embargo, la optimización de la cristalización fina fue necesaria para obtener grandes cristales individuales de calidad suficiente para la determinación de la estructura a una resolución casi atómica. Hasta la fecha, hay 134 estructuras cristalinas de triptófano sintasa depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), lo que representa 101, 31 y 2 estructuras cristalinas, respectivamente, para bacterias, arqueas y eucariotas. Muy bien, 73 estructuras pertenecen a S. enterica serovar typhimurium y 5 estructuras cristalinas del complejo α₂β₂StTS tienen límites de resolución superiores a 1.50 Angstroms. No en vano, 4 de cada 5 fueron preparados en nuestro grupo de investigación (PDB IDs:5CGQ a 1,18 Å, 4HT3 a 1,30 Å, 4HPJ a 1,45 Å, 6DZ4 a 1,45 Å de resolución). Se prevé que las estructuras cristalinas refinadas de la forma mutante del complejo α 2_β2StTS proporcionen nuevos conocimientos sobre el mecanismo y las funciones desempeñadas por los residuos de aminoácidos esenciales involucrados en la síntesis de L-triptófano.