ПЦР-мутагенез, клонирование, экспрессия, протоколы быстрой очистки белка и кристаллизация дикого типа и мутантных форм триптофанссинтазы

Комплекс бифермента триптофансинтаза (ТС) (α₂β₂₎является аллостерическим ферментом, катализируя последние две ступени биосинтеза аминокислоты L-триптофана у бактерий, растений и грибов^1,2,3. Бактерия Salmonella enterica serovar typhimurium (St)вызывает тяжелую желудочно-кишечную инфекцию у человека и других животных. Поскольку люди и высшие животные не имеют TS (EC 4.2.1.20), ингибирование S. typhimurium α₂β 2 TS complex (α₂ β₂StTS) было изучено в качестве потенциальной лекарственной мишени для лечения криптоспоридиоза и туберкулеза^4,генитальных и глазных инфекций⁵и для потенциального использования гербицидов в сельском хозяйстве^6. Α-субъединица катализирует альдолитическое расщепление индол-3-глицерин-фосфата (IGP) на глицеральдегид-3-фосфат (GAP) и индол, путем образования промежуточного продукта индоленина таутомера и последующего расщепления углерод-углеродных связей с образованием GAP и^{индола 3,6.} Β-каталитический сайт содержит молекулу кофактора пиридоксаль-5′-фосфата (PLP), связанную с β-Lys87 через основание Шиффа, которое функционирует как поглотитель электронов в ходе реакций на ферменте β-субъединичи^3,7. Β-сайт катализирует замену гидроксила L-сериновой боковой цепи индолом с целью получения L-триптофана и молекулы воды в PLP-зависимой реакции. Св TS служит давней моделью для исследования субстратного каналинга и аллостерической связи в мультиферментных комплексах^2,3. Двунаправленная аллостерическая связь между α- и β-субъединицами TS необходима для синхронизации каталитических этапов и предотвращения высвобождения индола при синтезе L-триптофана^3. Чтобы расширить эти усилия, мы подготовили несколько мутантов (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr и β-Ser377Ala) с помощью одноточечной мутации для использования в дальнейших исследованиях взаимосвязи между структурой фермента, механизмом и функцией в каталитическом месте stTS β-субъединой.

Детальное исследование каталитического механизма α₂β₂StTS было инициировано исследовательской группой Эдит У. Майлз. Ранние исследования с нативной кишечной палочкой α₂β₂ комплекса TS были сосредоточены на очистке и характеристике изолированного α-субъединицы^8,9,изолированной β-субъединицы^10,11 и воссоздании комплекса α₂β₂ TS из изолированных субъединиц^12. Очистку проводили осаждением сульфата аммония, диализом проб, хроматографией DEAE-Sephadex, диализом и вторым хроматографическим раундом на колонке¹²DEAE-Sephadex. В другом протоколе очистка того же комплекса была улучшена путем загрузки осветленного клеточного лизата на колонку DEAE-Sephadex с последующим хроматографическим шагом на колонку Sepharose 4B, осаждением сульфата аммония и диализом^13. Оба протокола очистки длятся 4-5 дней. Escherichia coli α₂β₂ TS комплекса кристаллизовалась, но кристаллы не были пригодны для дифракции рентгеновских лучей в то время.

В новом исследовании рекомбинантные и дикие формы S. typhimurium α₂β₂ TS комплекса были очищены и кристаллизованы^14,15. Рекомбинантный комплекс α₂β₂StTS был переэкспрессирован в штамме E. coli CB149, несущем вектор экспрессии pEBA-10. Сообщалось о сборе данных о первоначальной кристаллизации и рентгеновской дифракции и анализе α₂β₂комплексаStTS^14. Однако длинные и тонкие иглы, такие как α₂β₂кристаллаStTS, нарушали структурные исследования. В попытке собрать лучшие данные рентгеновской дифракции был описан другой протокол очистки для очистки дикого типа и мутантных форм α₂β₂Комплекса StTS^15. Очистку проводили с начальным осаждением с использованием спермина и ПЭГ 8000 в осветленный клеточный лисат и большой громоздкий осадок удаляли центрифугированием. Надпоменной фракции, содержащей большое количество α₂βкомплексе StTS_2,хранили в течение 16-48 ч при 4 °C до осаждения желтых кристаллов. Кристаллы промывали и широко диализовали против различных буферов. Белковый комплекс перекристаллизовали в буфер, содержащий сульфат аммония и диализовали^15. Хотя кристаллизация белка зависит от концентраций белка и осадителя в растворе, трудно контролировать, прогнозировать и воспроизводить очистку для других мутантных форм α₂β_{комплекса}StTS в растворе. Этот протокол имеет то преимущество, что он не использует никаких хроматографических методов; однако недостатками являются длительное время очистки, необходимое для кристаллизации, диализа и рекристаллизации, обычно требующее 5-7 дней. Для получения кристаллов, пригодных для сбора рентгеновских данных, оценивали более 600 условий кристаллизации с использованием комбинации и вариации концентрации белка, температуры, осадителей (ПЭГ 4000, 6000 и 8000) и добавок (CaCl_2,MnCl2,ZnCl_2,кадаверин, путресцин, спермин или спермидин)^15. Кристаллы имели лучшую кристаллическую форму и росли быстрее в условиях, содержащих 12% ПЭГ 8000 и 2 мМ спермина. Кристаллизация была более благоприятной при 25 °C, а не при 4, 30 или 42 °C, и выросла до максимальных размеров в течение 3^{дней 15.} На_{сегодняшний}день было зарегистрировано несколько α 2 β₂Кристаллическиеструктуры St TS (1996-1999)^16,17,^{18, 19,20,21} и многие другие структуры.

Здесь основной целью является представление альтернативных протоколов для очистки триптофансинтазы и оптимизации кристаллизации белка. Настоящая работа показывает значительные улучшения для очистки дикого типа, изолированного α-субъединицы (αStTS), изолированной β-субъединицы (βStTS), воссозданной α₂β₂Комплекса StTS из изолированных субъединиц, а также дикого типа и мутантных форм комплекса α₂β₂StTS. Преимущества по сравнению с прошлыми протоколами значительны, поскольку время очистки было значительно сокращено, а кристаллизация и криозащита были оптимизированы. Мутантные формы α₂β₂St TSкомплекса,спроектированные в этой работе, кристаллизовались почти в том же состоянии, что и для формы дикого типа. Однако оптимизация тонкой кристаллизации была необходима для получения крупных монокристаллов достаточного качества для определения структуры при близком к атомному разрешению. На сегодняшний день в Банке данных белка (PDB) депонировано 134 кристаллические структуры триптофансинтаз, что составляет 101, 31 и 2 кристаллические структуры, соответственно, для бактерий, архей и эукариот. 73 структуры принадлежат к S. enterica serovar typhimurium и 5 кристаллических структур комплекса α₂β₂StTS имеют пределы разрешения выше 1,50 Ангстрема. Неудивительно, что 4 из 5 были подготовлены в нашей исследовательской группе (PDB IDs: 5CGQ при 1,18 Å, 4HT3 при 1,30 Å, 4HPJ при 1,45 Å, 6DZ4 при разрешении 1,45 Å). Ожидается, что уточненные кристаллические структуры мутантной формы комплекса α₂β₂StTS обеспечат новое понимание механизма и роли, которые играют эфирные аминокислотные остатки, участвующие в синтезе L-триптофана.