PCR変異生成、クローニング、発現、高速タンパク質精製プロトコルおよびトリプトファン合成酵素の野生型および変異型の結晶化

トリプトファン合成酵素(TS)バイ酵素複合体(α 2 β 2)は、アクロステリック酵素であり、細菌、植物、および真菌^1、2、3におけるアミノ酸L-トリプトファンの生合成における最後の2つのステップを触媒する。サルモネラ菌腸管腸炎セロバル腸管(St)は、ヒトおよび他の動物において重篤な胃腸感染症を引き起こす。ヒトおよび高等動物はTS(EC 4.2.1.20)を有しないため、S.チフィムリウムα 2 β 2 TS複合体(α 2 β 2StTS)の阻害は、クリプトスポリジウム症および結核^4、生殖器および眼感染症⁵の治療のための潜在的な薬物標的として探求^{されてきた。} αサブユニットは、インドール-3-グリセロールリン酸(IGP)からグリセアルデヒド-3-リン酸(GAP)およびインドールへのアルドー分解切断を触媒し、インドールトタクマー中間体の形成を経て、その後、炭素結合切断を経てGAPとインドール^3,6を生成する。β触媒部位には、シッフ塩基を介してβ-Lys87に結合したピリドキサール5′リン酸(PLP)補因子分子が含まれており、これは酵素βサブユニット^3,7での反応の過程で電子シンクとして機能する。β部位は、L-トリプトファンおよびPLP依存反応中の水分子を与えるためにインドールによるL-セリン側鎖ヒドロキシルの置換を触媒する。セントTSは、多酵素複合体^2,3内における基質チャネリングおよびアロステリック通信の調査のための長年のモデルとして機能する。TSのαとβサブユニット間の双方向のアロステリック通信は、触媒ステップを同期させ、L-トリプトファン合成中のインドール放出を防止するために必要である^3。この取り組みを拡張するために、StTS βサブユニットの触媒部位における酵素構造、メカニズムおよび機能の関係をさらに探求するために、単一点突然変異(β-Gln114Ala、β-Lys167Thr、およびβ-Ser377Ala)によっていくつかの変異体を調製しました。

α₂β₂StTS の触媒機構に関する詳細な研究は、エディス W. マイルズの研究グループによって開始されました。天然大腸菌_{α 2 β 2}TS複合体を用いた初期の研究は、単離されたαサブユニット^8、9、単離βサブユニット^10、11、およびα 2 β 2TS複合体の分離サブユニット¹²からの再構成の精製および特徴付けに焦点を当てている。精製は硫酸アンモニウム沈殿、サンプル透析、DEAE-セファデックスクロマトグラフィー、透析、およびDEAE-セファデックスカラム¹²上の第2のクロマトグラフィーラウンドによって行った。別のプロトコルでは、同じ複合体の精製は、明確化された細胞リセートをDEAE-Sephadexカラムにロードし、続いてセファローズ4Bカラムにクロマトグラフィーステップを行い、硫酸アンモニウム沈殿および透析¹³を行うことで改善された。両方の精製プロトコルは4〜5日間続きます。エシェリヒア・コリ_{α 2 β 2}TS錯体が結晶化したが、当時のX線回折には結晶が適していなかった。

新規研究では、S.チフィムリウム_{α 2 β 2TS}複合体の組換えおよび野生型形態を精製し^、14,15を結晶化した。組換えα 2 β 2St TS複合体は、pEBA-10発現ベクターを担持した大腸菌株CB149において過剰発現した。初期結晶化およびX線回折データの収集_と分析2stTS複合体β α 2の収集と分析は^、14を報告した。しかし、2 β 2StTS結晶αのような長くて細い針は構造研究を損なった。より良いX線回折データを収集する試みにおいて、α 2 β St TS複合体¹⁵の野生型および変異型を精製する別の精製プロトコルが記載された。精製は、スペルミンおよびPEG8,000を用いた初期沈殿を用いて精製した細胞リセートに行い、遠心分離により大きなかさばる沈殿物を除去した。高量の_{α 2 β 2St}TS複合体を含む上清画分を、黄色の結晶が析出するまで4°Cで16〜48時間保存した。結晶を洗浄し、異なるバッファーに対して広範囲に透析した。タンパク質複合体は、硫酸アンモニウムを含む緩衝液中で再結晶化し^、15.15を透析した。タンパク質の結晶化は、溶液中のタンパク質および沈殿物濃度に依存するが、α 2 β 2StTS複合体の他の変異型の精製を、溶液中で監視、予測、再生することは困難である。このプロトコルには、クロマトグラフィー法を使用しないという利点があります。しかしながら、欠点は、結晶化、透析、再結晶化に必要な長い精製時間であり、典型的には5〜7日を要する。X線データ収集に適した結晶を得るために、600以上の結晶化条件を、タンパク質濃度、温度、沈殿物(PEG4,000、6,000、および8,000)の組み合わせおよび変動を用いて評価^した。結晶はより良い結晶形態を持ち、12%PEG 8,000および2 mMのスペルミンを含む条件でより速く成長した。結晶化は4、30、または42°Cではなく25°Cでより好ましく、3日以内に最大寸法¹⁵に成長した。当時の_{α 2 β 2}StTS結晶構造(1996-1999)16、17、18、19、20、21、その他多くの構造がこれまでに発表されています。

ここで、主な目的は、トリプトファン合成酵素を精製し、タンパク質の結晶化を最適化するための代替プロトコルを提示することです。本研究は、野生型単離αサブユニット(α St TS)、単離βサブユニット(β St TS)、2 β 2stTS複合体 αを単離されたサブユニットから再構成し、α 2 β 2St TS複合体の野生型および変異型を精製するための有意な改善を示す。 精製時間が大幅に短縮され、結晶化と凍結保護が最適化されるため、過去のプロトコルに対する利点はかなり高いものです。本研究で設計されたα 2 β 2St TS複合体の変異型は、野生型形態に使用される同じ条件付近で結晶化している。しかし、微細結晶化最適化は、原子分解に近いところで構造決定に十分な品質の大きな単結晶を得る必要があった。現在までに、タンパク質データバンク(PDB)に堆積した134のトリプトファン合成酵素結晶構造があり、細菌、古細菌および真核生物に関してそれぞれ101、31、2の結晶構造を考慮しています。うまく、73の構造はS.エンテラバーチフィムリウムに属し、α 2 β 2StTS複合体の5つの結晶構造は1.50オングストロームよりも高い解像度制限を有する。当然のことながら、4アウト5は、私たちの研究グループ(PDB ID:5CGQは1.18 Å、4HT3は1.30 Å、4HPJは1.45 Å、6DZ4は1.45 Å解像度で)で作成されました。2stTS複合体α 2 βの変異型の洗練された結晶構造は、L-トリプトファン合成に関与する必須アミノ酸残基が果たすメカニズムおよび役割に関する新たな洞察を提供することが期待される。