Mutagenesi PCR, clonazione, espressione, protocolli di purificazione rapida delle proteine e cristallizzazione del tipo selvatico e delle forme mutanti di triptofano sintasi

Il complesso bienzimatico della triptofano sintasi (TS) (α₂β₂₎è un enzima allosterico, catalizzando gli ultimi due passaggi nella biosintesi dell’amminoacido L-triptofano in batteri, piante e funghi^1,2,3. Bacterium Salmonella enterica serovar typhimurium (St) provoca una grave infezione gastrointestinale nell’uomo e in altri animali. Poiché gli esseri umani e gli animali superiori non hanno TS (EC 4.2.1.20), l’inibizione del complesso S. typhimurium α₂β₂ TS (α₂β₂StTS) è stata esplorata come potenziale bersaglio farmacologico per il trattamento della criptosporidiosi e della tubercolosi⁴, genitali e infezioni oculari⁵e per il potenziale utilizzo di erbicidi in agricoltura⁶. La α-subunità catalizza la scissione aldolitica dell’indolo-3-glicerolo-fosfato (IGP) a gliceraldeide-3-fosfato (GAP) e indolo, attraverso la formazione di un intermedio tautomero indolenino e successivamente scissione del legame carbonio-carbonio per produrre GAP e indolo^3,6. Il sito β-catalitico contiene una molecola cofattore piridossiale 5′-fosfato (PLP) legata a β-Lys87 tramite una base di Schiff, che funziona come un dissipatore di elettroni nel corso delle reazioni all’enzima β-subunità^3,7. Il sito β catalizza la sostituzione dell’idrossile della catena laterale L-Serina con l’indolo per dare L-triptofano e una molecola d’acqua in una reazione PLP-dipendente. St TS funge da modello di lunga data per lo studio della canalizzazione del substrato e della comunicazione allosterica all’interno di complessi multienzimatici^2,3. La comunicazione allosterica bidirezionale tra le subunità α e β di TS è necessaria per sincronizzare le fasi catalitiche e prevenire il rilascio di indolo durante la sintesi di L-triptofano³. Per estendere questo sforzo, abbiamo preparato diversi mutanti (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr e β-Ser377Ala) per mutazione a punto singolo da utilizzare in ulteriori esplorazioni della relazione tra struttura enzimatica, meccanismo e funzione nel sito catalitico della subunità β StTS.

Una ricerca dettagliata sul meccanismo catalitico di α₂β₂StTS è stata avviata dal gruppo di ricerca di Edith W. Miles. I primi studi con il complesso nativo di Escherichia coli α₂β₂ TS si sono concentrati sulla purificazione e caratterizzazione della α-subunità^{isolata 8,9,}isolata β-subunità^10,11 e sulla ricostituzione del complesso TS α 2_β2 dalle subunità^{isolate 12.} La purificazione è stata effettuata mediante precipitazione del solfato di ammonio, dialisi del campione, cromatografia DEAE-Sephadex, dialisi e un secondo round cromatografico su una colonna DEAE-Sephadex¹². In un altro protocollo, la purificazione dello stesso complesso è stata migliorata caricando il lisato cellulare chiarificato su una colonna DEAE-Sephadex seguita da una fase cromatografica su una colonna Sepharose 4B, precipitazione del solfato di ammonio e dialisi¹³. Entrambi i protocolli di purificazione durano 4-5 giorni. Escherichia coli α_{complesso TS 2}β₂ cristallizzato, ma i cristalli non erano adatti per la diffrazione a raggi X in quel momento.

In un nuovo studio, le forme ricombinanti e selvatiche di S. typhimurium α₂β₂ TS complesso sono state purificate e cristallizzate^14,15. Il complesso α₂β₂StTS ricombinante è stato sovraespresso nel ceppo CB149 di E. coli che trasporta il vettore di espressione pEBA-10. Sono stati riportati dati iniziali di cristallizzazione e diffrazione a raggi X e analisi del complesso α₂β₂StTS¹⁴. Tuttavia, l’ago lungo e sottile come α₂β₂StTS cristalli ha compromesso gli studi strutturali. Nel tentativo di raccogliere migliori dati di diffrazione a raggi X, è stato descritto un altro protocollo di purificazione per purificare il tipo selvatico e le forme mutanti del complesso α₂β₂StTS¹⁵. La purificazione è stata effettuata con una precipitazione iniziale utilizzando spermina e PEG 8.000 nel lisato cellulare chiarificato e un grande precipitato voluminoso è stato rimosso mediante centrifugazione. La frazione surnatante contenente elevate quantità di α₂β₂StTS è stata conservata per 16-48 ore a 4 °C fino a quando i cristalli gialli non sono precipitati. I cristalli sono stati lavati e ampiamente dializzati contro diversi buffer. Il complesso proteico è stato ricristallizzato in tampone contenente solfato di ammonio e dializzato¹⁵. Sebbene la cristallizzazione delle proteine dipenda dalle concentrazioni di proteine e precipitanti in soluzione, è difficile monitorare, prevedere e riprodurre la purificazione per altre forme mutanti di α_{complesso TS 2}β₂Stin soluzione. Questo protocollo ha il vantaggio di non utilizzare alcun metodo cromatografico; tuttavia, gli svantaggi sono il lungo tempo di purificazione necessario per cristallizzare, dializzare e ricristallizzare, in genere richiedendo 5-7 giorni. Per ottenere cristalli adatti alla raccolta di dati a raggi X, sono state valutate più di 600 condizioni di cristallizzazione utilizzando una combinazione e variazione di concentrazione proteica, temperatura, precipitanti (PEG 4.000, 6.000 e 8.000) e additivi (CaCl_2,MnCl_{2,ZnCl 2,}cadaverina, putrescina, spermina o spermidina)^15. I cristalli avevano una forma cristallina migliore e crescevano più velocemente in condizioni contenenti il 12% di PEG 8.000 e 2 mM di spermina. La cristallizzazione era più favorevole a 25 °C piuttosto che a 4, 30 o 42 °C e cresceva fino alle dimensioni massime entro 3 giorni^{e 15.} Diverse strutture cristalline α₂β₂StTS sono state segnalate in quel momento (1996-1999)^{16,17,18,19,20,21} e molte altre strutture sono state pubblicate fino ad oggi.

Qui, lo scopo principale è quello di presentare protocolli alternativi per purificare la triptofano sintasi e ottimizzare la cristallizzazione delle proteine. Il presente lavoro mostra miglioramenti significativi per purificare la subunità α isolata di tipo selvatico (αStTS), la subunità β isolata (βStTS), ricostituita α complesso_{TS 2}β₂Stdalle subunità isolate e forme wild type e mutanti del complesso α₂β₂StTS. I vantaggi rispetto ai protocolli passati sono considerevoli poiché il tempo di purificazione è stato ridotto in modo significativo e la cristallizzazione e la crioprotezione sono state ottimizzate. Le forme mutanti del complesso α 2 β₂StTS progettate in questo lavoro si sono cristallizzate vicino alla_stessacondizione utilizzata per la forma wild type. Tuttavia, l’ottimizzazione della cristallizzazione fine era necessaria per ottenere grandi cristalli singoli di qualità sufficiente per la determinazione della struttura a risoluzione quasi atomica. Ad oggi, ci sono 134 strutture cristalline di triptofano sintasi depositate nella Protein Data Bank (PDB), che rappresentano rispettivamente 101, 31 e 2 strutture cristalline per batteri, archaea ed eucarioti. Piacevolmente, 73 strutture appartengono a S. enterica serovar typhimurium e 5 strutture cristalline del complesso α₂β₂StTS hanno limiti di risoluzione superiori a 1,50 Angstrom. Non sorprende che 4 su 5 siano stati preparati nel nostro gruppo di ricerca (PDB IDs: 5CGQ a 1,18 Å, 4HT3 a 1,30 Å, 4HPJ a 1,45 Å, 6DZ4 a 1,45 Å risoluzione). Si prevede che le raffinate strutture cristalline della forma mutante del complesso α 2_β2StTS forniranno nuove informazioni sul meccanismo e sui ruoli svolti dai residui di aminoacidi essenziali coinvolti nella sintesi di L-triptofano.