PCR מוטגנסיס, שיבוט, ביטוי, פרוטוקולי טיהור חלבונים מהירים והתגבשות של סוג הבר וצורות מוטציה של טריפטופן סינתאז

קומפלקס הדו-אנזים (TS) (α₂β₂₎הוא אנזים אלוסטרית, המזרז את שני השלבים האחרונים בביוסינתזה של חומצת האמינו L-טריפטופן בחיידקים, צמחים ופטריות^1,2,3. חיידק סלמונלה אנטטיקה שרף שרף ( St) גורם לזיהום חמור במערכת העיכול בבני אדם ובבעלי חיים אחרים. מאז בני אדם ובעלי חיים גבוהים אין TS (EC 4.2.1.20), עיכוב של S. טיפוס α₂β₂ תסביך TS (α₂β₂StTS) נחקר כיעד תרופה פוטנציאלי לטיפול cryptosporidiosis ושחפת⁴, זיהומים באברי המין והעיקולים⁵, ועל ניצול פוטנציאלי של קוטלי עשבים בחקלאות⁶. α-subunit מזרז את המחשוף האלדוליטי של אינדול-3-גלייצרול-פוספט (IGP) כדי הגליצרלדהיד-3-פוספט (GAP) והאינדול, באמצעות היווצרות של טאוטומר אינדולנין ביניים ולאחר מכן מחשוף קשר פחמן-פחמן כדי לייצר GAP ו indole^3,6. האתר β-קטליטי מכיל מולקולת קופקטור פירידוקסלית 5′-פוספט (PLP) הקשורה β-Lys87 דרך בסיס שיף, המתפקד ככיור אלקטרונים במהלך התגובות באנזים β-subunit^3,7. האתר β מזרז את החלפת ההידרוקסיל בצד L-Serine על ידי אינדול כדי לתת L-טריפטופן ומולקולת מים בתגובה תלויה PLP. סנט TS משמש מודל ארוך שנים לחקירת תקשור מצע ותקשורת אלוסטרה בתוך מתחמים מרובי אנזימים^2,3. תקשורת אלוסטרית דו-כיוונית בין α ואיחודי המשנה β של TS נחוצה כדי לסנכרן את השלבים הקטליטיים ולמנוע שחרור אינודול במהלך סינתזה L-טריפטופן³. כדי להאריך את המאמץ הזה, הכנו מספר מוטציות (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr, ו- β-Ser377Ala) על ידי מוטציה של נקודה אחת שישמשו לחקר נוסף של הקשר בין מבנה האנזים, המנגנון והתפקוד באתר הקטליטי של stTS β-subunit.

מחקר מפורט על המנגנון הקטליטי של α₂β₂סנטTS יזם על ידי קבוצת המחקר של אדית וו מיילס. מחקרים מוקדמים עם ילידי Escherichia coli α₂β₂ TS מורכבים התמקדו בטיהור ואפיון של α-subunit מבודד^8,9, מבודד β-subunit^10,11 ואת השבת α₂β_{2 מתחם} TS מן subunits מבודד¹². הטיהור בוצע על ידי משקעים אמוניום גופרתי, דיאליזה לדוגמה, כרומטוגרפיה DEAE-Sephadex, דיאליזה, וסיבוב כרומטוגרפי שני על טור DEAE-Sephadex¹². בפרוטוקול אחר, הטיהור של אותו קומפלקס שופר על ידי טעינת lysate התא המובהר על עמוד DEAE-Sephadex ואחריו צעד כרומטוגרפי על עמוד Sepharose 4B, משקעים אמוניום גופרתי ודיאליזה¹³. שני פרוטוקולי הטיהור נמשכים 4-5 ימים. Escherichia coli α₂β₂ TS מורכב מגובש אבל גבישים לא היו מתאימים עקיפה רנטגן באותו זמן.

במחקר חדשני, צורות רקומביננטיות ופראיות של S. typhimurium α₂β₂ תסביך TS טוהרו וגובשו^14,15. מתחם ה-CB149 של α רקומביננטי₂β 2StTS הובע יתר על_המידהבזן E. coli CB149 הנושא את וקטור הביטוי pEBA-10. התגבשות ראשונית ואיסוף וניתוח נתוני עקיפה של קרני רנטגן של מתחם α₂β₂StTS דווחו¹⁴. עם זאת, מחט ארוכה ודקה כמו α₂β₂גבישיסנטTS לקוי מחקרים מבניים. בניסיון לאסוף נתוני עקיפה טובים יותר של קרני רנטגן, תואר פרוטוקול טיהור נוסף כדי לטהר את הסוג הפראי ואת צורות המוטציה של α₂β₂StTS^{מתחם 15}. הטיהור בוצע עם משקעים ראשוניים באמצעות זרע ו PEG 8,000 לתוך ליסאט התא המובהק ומצרף גדול מגושם הוסר על ידי צנטריפוגה. השבר העל-טבעי המכיל כמויות גבוהות של α₂β₂StTS מתחם אוחסנו במשך 16-48 שעות ב 4 °C (70 °F) עד גבישים צהובים מזורם. גבישים נשטפו ודיאליגו בהרחבה כנגד מאגרים שונים. קומפלקס החלבון היה recrystallized במאגר המכיל אמוניום גופרתי וחיוג¹⁵. אמנם, התגבשות חלבון תלויה בחלבון ובריכוזים מזרזים בתמיסה, קשה לפקח, לחזות ולהתרבות טיהור לצורות מוטנטיות אחרות של α₂β₂StTS תסביך. לפרוטוקול זה יש יתרון בכך שהוא אינו משתמש בשיטות כרומטוגרפיות כלשהן; עם זאת, החסרונות הם זמן הטיהור הארוך הדרוש כדי להתגבש, לחייג ולבטל, הדורש בדרך כלל 5-7 ימים. כדי להשיג גבישים המתאימים לאיסוף נתוני רנטגן, יותר מ -600 תנאי התגבשות הוערכו באמצעות שילוב וריאציה של ריכוז חלבון, טמפרטורה, משקעים (PEG 4,000, 6,000, ו 8,000), ותוספים (CaCl₂, MnCl₂, ZnCl₂, cadaverine, putrescine, זרע, או זרע)¹⁵. גבישים היו בצורת גבישית טובה יותר וגדלו מהר יותר בתנאים המכילים 12% PEG 8,000 ו 2 mM זרעון. ההתגבשות הייתה חיובית יותר ב 25 °C (75 °F) ולא ב 4, 30, או 42 °C (5 °F) גדל לממדים מקסימליים בתוך 3 ימים¹⁵. כמה α₂β_שנימבני גבישסנטTS דווחו באותה תקופה (1996-1999)¹⁶,^{17,18,19,20,21} ומבנים רבים אחרים פורסמו עד כה.

כאן, המטרה העיקרית היא להציג פרוטוקולים חלופיים כדי לטהר סינתאז טריפטופן ולמטב את התגבשות חלבון. העבודה הנוכחית מציגה שיפורים משמעותיים כדי לטהר את סוג הפרא מבודד α-subunit (αStTS), מבודד β-subunit (βStTS), מחדש α₂β₂סנטTS המתחם מן subunits מבודד, וסוג פראי וצורות מוטציה של α₂β₂מתחם סנטTS. היתרונות על פני פרוטוקולים קודמים ניכרים שכן זמן הטיהור צומצם באופן משמעותי והתגבשות והגנה קריו-הגנתית היו מותאמים. צורות מוטנטיות של α₂β_{2 מתחם}סנטTS מהונדס בעבודה זו התגבשו ליד אותו מצב המשמש עבור צורת סוג הבר. עם זאת, אופטימיזציה התגבשות בסדר היה צורך להשיג גבישים יחיד גדול באיכות מספקת לקביעת מבנה ברזולוציה אטומית קרובה. עד כה, ישנם 134 מבני קריסטל סינתאז טריפטופן שהופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB), חשבונאות 101, 31 ו -2 מבני קריסטל, בהתאמה, עבור חיידקים, ארכאי ואאוקריוטה. יפה, 73 מבנים שייכים S. enterica serovar typhimurium ו 5 מבני קריסטל של α₂β₂סנטTS מתחם יש מגבלות רזולוציה גבוהות יותר מ 1.50 אנגסטרום. באופן לא מפתיע, 4 מתוך 5 הוכנו בקבוצת המחקר שלנו (מזהי PDB:5CGQ ב 1.18 Å, 4HT3 ב 1.30 Å, 4HPJ ב 1.45 Å, 6DZ4 ברזולוציה 1.45 Å). מבני הגביש המעודנים של צורה מוטנטית של α₂β₂StTS קומפלקס צפויים לספק תובנות חדשות על המנגנון והתפקידים שיחקו שאריות חומצת אמינו חיונית המעורבים בסינתזה L-טריפטופן.