PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

Der Tryptophansynthase (TS) Bienzymkomplex (α₂β₂₎ist ein allosterisches Enzym, das die letzten beiden Schritte in der Biosynthese der Aminosäure L-Tryptophan in Bakterien, Pflanzen und Pilzen katalysiert^1,2,3. Das Bakterium Salmonella enterica serovar typhimurium (St) verursacht eine schwere Magen-Darm-Infektion bei Menschen und anderen Tieren. Da Menschen und höhere Tiere kein TS (EC 4.2.1.20) haben, wurde die Hemmung von S. typhimurium α₂β₂ TS-Komplex (α₂β₂StTS) als potenzielles Wirkstoffziel für die Behandlung von Kryptosporidiose und Tuberkulose⁴, Genital- und Augeninfektionen⁵und für den möglichen Herbizideinsatz in der Landwirtschaft⁶untersucht. Die α-Untereinheit katalysiert die aldolytische Spaltung von Indol-3-Glycerinphosphat (IGP) zu Glyceraldehyd-3-phosphat (GAP) und Indol, durch die Bildung eines Indolenin-Tautomer-Zwischen- und anschließenden Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungsspaltungsspaltung zur Herstellung von GAP und Indol^3,6. Die β-katalytische Stelle enthält ein pyridoxalen 5′-Phosphat (PLP)-Cofaktormolekül, das über eine Schiff-Base an β-Lys87 gebunden ist, das im Verlauf der Reaktionen am Enzym β-Untereinheit^3,7als Elektronensenke fungiert. Die β-Stelle katalysiert den Ersatz des L-Serin-Seitenkettenhydroxyls durch Indol, um L-Tryptophan und ein Wassermolekül in einer PLP-abhängigen Reaktion zu erhalten. St. TS dient als langjähriges Modell zur Untersuchung der Substratkanalisierung und allosterischen Kommunikation innerhalb von Multienzymkomplexen^2,3. Die bidirektionale allosterische Kommunikation zwischen den α- und β-Untereinheiten von TS ist notwendig, um die katalytischen Schritte zu synchronisieren und die Indolfreisetzung während der L-Tryptophan-Synthese zu verhindern³. Um diese Bemühungen zu erweitern, haben wir mehrere Mutanten (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr und β-Ser377Ala) durch Einzelpunktmutation vorbereitet, die bei weiteren Untersuchungen der Beziehung zwischen Enzymstruktur, Mechanismus und Funktion an der katalytischen Stelle der St.TS-β-Untereinheit verwendet werden sollen.

Detaillierte Forschungen zum katalytischen Mechanismus von α₂β₂StTS wurden von der Forschungsgruppe von Edith W. Miles initiiert. Frühe Studien mit nativen Escherichia coli α₂β₂ TS-Komplex konzentrierten sich auf die Reinigung und Charakterisierung der isolierten α-Untereinheit^8,9, isolierten β-Untereinheit^10,11 und die Rekonstitution des α₂β₂ TS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten¹². Die Reinigung erfolgte durch Ammoniumsulfatfällung, Probendialyse, DEAE-Sephadex-Chromatographie, Dialyse und eine zweite chromatographische Runde auf einer DEAE-Sephadex-Säule^12. In einem anderen Protokoll wurde die Reinigung desselben Komplexes verbessert, indem das geklärte Zelllysat auf eine DEAE-Sephadex-Säule geladen wurde, gefolgt von einem chromatographischen Schritt auf einer Sepharose-4B-Säule, Ammoniumsulfatfällung und Dialyse^13. Beide Reinigungsprotokolle dauern 4-5 Tage. Escherichia coli α₂β₂ TS Komplex kristallisiert, aber Kristalle waren zu dieser Zeit nicht für die Röntgenbeugung geeignet.

In einer neuartigen Studie wurden rekombinante und Wildtypformen von S. typhimurium α₂β₂ TS-Komplex gereinigt und^{kristallisiert 14,15}. Der rekombinante α₂β₂StTS-Komplex wurde im E. coli-Stamm CB149 überexprimiert, der den pEBA-10-Expressionsvektor trug. Erste Kristallisations- und Röntgenbeugungsdatenerfassung und Analyse des α₂β₂StTS-Komplexes wurden berichtet¹⁴. Lange und dünne Nadeln wie α₂β₂StTS-Kristalle beeinträchtigten jedoch die Strukturstudien. In einem Versuch, bessere Röntgenbeugungsdaten zu sammeln, wurde ein anderes Reinigungsprotokoll beschrieben, um den Wildtyp und die mutierten Formen des α₂β₂StTS-Komplexes¹⁵zu reinigen. Die Reinigung erfolgte mit einer anfänglichen Ausfällung mit Spermin und PEG 8.000 in das geklärte Zelllysat und ein großer sperriger Niederschlag wurde durch Zentrifugation entfernt. Die überstandige Fraktion, die hohe Mengen an α₂β₂StTS-Komplex enthielt, wurde 16-48 h bei 4 °C gelagert, bis gelbe Kristalle ausbrachen. Kristalle wurden gewaschen und ausgiebig gegen verschiedene Puffer dialysiert. Proteinkomplex wurde in Ammoniumsulfat enthaltenden Puffer rekristallisiert und dialysiert¹⁵. Obwohl die Proteinkristallisation von den Protein- und Fällungsmittelkonzentrationen in Lösung abhängt, ist es schwierig, die Reinigung für andere mutierte Formen des α₂β₂StTS-Komplexes in Lösung zu überwachen, vorherzusagen und zu reproduzieren. Dieses Protokoll hat den Vorteil, dass es keine chromatographischen Methoden verwendet; Die Nachteile sind jedoch die lange Reinigungszeit, die zum Kristallisieren, Dialysieren und Rekristallisieren erforderlich ist und typischerweise 5-7 Tage benötigt. Um Kristalle zu erhalten, die für die Röntgendatenerfassung geeignet sind, wurden mehr als 600 Kristallisationsbedingungen unter Verwendung einer Kombination und Variation von Proteinkonzentration, Temperatur, Fällungsmitteln (PEG 4.000, 6.000 und 8.000) und Additiven (CaCl₂, MnCl₂, ZnCl₂, Cadaverin, Putrescin, Spermin oder Spermidin)^{bewertet 15}. Kristalle hatten eine bessere kristalline Form und wuchsen schneller unter Bedingungen, die 12% PEG 8.000 und 2 mM Spermin enthielten. Die Kristallisation war bei 25 °C günstiger als bei 4, 30 oder 42 °C und wuchs innerhalb von 3 Tagen auf maximale Abmessungen^{an 15}. Mehrere α₂β₂StTS Kristallstrukturen wurden damals (1996-1999) berichtet^{16,17,18,19,20,21} und viele andere Strukturen wurden bis heute veröffentlicht.

Hier besteht der Hauptzweck darin, alternative Protokolle zur Reinigung der Tryptophansynthase und zur Optimierung der Proteinkristallisation vorzustellen. Die vorliegende Arbeit zeigt signifikante Verbesserungen zur Reinigung des Wildtyps isoliert α-Untereinheit (αStTS), isolierter β-Untereinheit (βStTS), rekonstituiert α₂β₂StTS-Komplexes aus den isolierten Untereinheiten, und Wildtyp- und Mutantenformen des α₂β₂StTS-Komplexes. Die Vorteile gegenüber früheren Protokollen sind beträchtlich, da die Reinigungszeit deutlich verkürzt und Kristallisation und Kryoprotektion optimiert wurden. Mutantenformen von α₂β₂StTS-Komplexes, die in dieser Arbeit entwickelt wurden, haben sich in der Nähe des gleichen Zustands kristallisiert, der für die Wildtypform verwendet wird. Eine Feinkristallisationsoptimierung war jedoch notwendig, um große Einkristalle von ausreichender Qualität für die Strukturbestimmung bei nahezu atomarer Auflösung zu erhalten. Bis heute sind in der Protein Data Bank (PDB) 134 Tryptophansynthase-Kristallstrukturen hinterlegt, die 101, 31 bzw. 2 Kristallstrukturen für Bakterien, Archaeen und Eukaryoten ausmachen. Schönerweise gehören 73 Strukturen zu S. enterica serovar typhimurium und 5 Kristallstrukturen des α₂β₂StTS-Komplexes haben Auflösungsgrenzen von mehr als 1,50 Angström. Es überrascht nicht, dass 4 von 5 in unserer Forschungsgruppe vorbereitet wurden (PDB IDs: 5CGQ bei 1,18 Å, 4HT3 bei 1,30 Å, 4HPJ bei 1,45 Å, 6DZ4 bei 1,45 Å Auflösung). Die raffinierten Kristallstrukturen der mutierten Form von α₂β₂StTS-Komplexes sollen neue Einblicke in den Mechanismus und die Rolle liefern, die essentielle Aminosäurereste bei der L-Tryptophan-Synthese spielen.