Mutagénèse par PCR, clonage, expression, protocoles de purification rapide des protéines et cristallisation du type sauvage et des formes mutantes de la tryptophane synthase

Le complexe bienzyme tryptophane synthase (TS) (α₂β₂₎est une enzyme allostérique, catalysant les deux dernières étapes de la biosynthèse de l’acide aminé L-tryptophane chez les bactéries, les plantes et les champignons^1,2,3. Bacterium Salmonella enterica serovar typhimurium (St) provoque une infection gastro-intestinale grave chez les humains et d’autres animaux. Étant donné que les humains et les animaux supérieurs n’ont pas de TS (EC 4.2.1.20), l’inhibition de S. typhimurium α complexe_TS2 β₂ (α₂β₂StTS) a été explorée comme cible médicamenteuse potentielle pour le traitement de la cryptosporidiose et de la tuberculose⁴, les infections génitales et oculaires⁵, et pour l’utilisation potentielle d’herbicides dans l’agriculture⁶. La sous-unité α catalyse le clivage aldolytique de l’indole-3-glycérol-phosphate (IGP) en glycéraldéhyde-3-phosphate (GAP) et indole, par la formation d’un intermédiaire tautomère d’indolénine et par la suite d’un clivage de liaison carbone-carbone pour produire du GAP et de l’indole^3,6. Le site β-catalytique contient une molécule de cofacteur pyridoxal 5′-phosphate (PLP) liée à β-Lys87 via une base de Schiff, qui fonctionne comme un puits d’électrons au cours des réactions à l’enzyme β-sous-unité^3,7. Le β-site catalyse le remplacement de l’hydroxyle à chaîne latérale L-Sérine par l’indole pour donner du L-Tryptophane et une molécule d’eau dans une réaction dépendante du PLP. Rue St TS sert de modèle de longue date pour l’étude de la canalisation du substrat et de la communication allostérique dans les complexes multi-enzymatiques^2,3. Une communication allostérique bidirectionnelle entre les sous-unités α et β du TS est nécessaire pour synchroniser les étapes catalytiques et empêcher la libération d’indole lors de la synthèse du L-tryptophane^3. Pour étendre cet effort, nous avons préparé plusieurs mutants (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr et β-Ser377Ala) par mutation ponctuelle à utiliser dans d’autres explorations de la relation entre la structure, le mécanisme et la fonction enzymatiques sur le site catalytique de la sous-unité β StTS.

Des recherches détaillées sur le mécanisme catalytique de α₂β₂StTS ont été initiées par le groupe de recherche d’Edith W. Miles. Les premières études avec le complexe natif Escherichia coli α₂β₂ TS se sont concentrées sur la purification et la caractérisation de la sous-unité α isolée^8,9, isolée β-sous-unité^10,11 et la reconstitution du complexe TS α₂β₂ à partir des sous-unités isolées¹². La purification a été réalisée par précipitation de sulfate d’ammonium, dialyse d’échantillons, chromatographie DEAE-Sephadex, dialyse, et un deuxième tour chromatographique sur une colonne DEAE-Sephadex^12. Dans un autre protocole, la purification du même complexe a été améliorée en chargeant le lysate cellulaire clarifié sur une colonne DEAE-Sephadex suivie d’une étape chromatographique sur une colonne Sepharose 4B, d’une précipitation de sulfate d’ammonium et d’une dialyse^13. Les deux protocoles de purification durent 4-5 jours. Escherichia coli α₂β₂ TS complexes cristallisés, mais les cristaux ne convenaient pas à la diffraction des rayons X à cette époque.

Dans une nouvelle étude, des formes recombinantes et de type sauvage de S. typhimurium α₂β₂ TS ont été purifiées et cristallisées^14,15. Le complexe recombinant α₂β₂StTS a été surexprimé dans la souche CB149 d’E. coli portant le vecteur d’expression pEBA-10. La collecte et l’analyse initiales des données de cristallisation et de diffraction des rayons X du complexe TS_α2 β₂Stont été rapportées¹⁴. Cependant, des aiguilles longues et minces comme α_{cristaux de 2}β₂StTS ont altéré les études structurelles. Dans une tentative de recueillir de meilleures données de diffraction des rayons X, un autre protocole de purification a été décrit pour purifier le type sauvage et les formes mutantes du complexe α₂β₂StTS¹⁵. La purification a été effectuée avec une précipitation initiale à l’aide de spermine et de PEG 8 000 dans le lysate cellulaire clarifié et un grand précipité volumineux a été éliminé par centrifugation. La fraction surnageante contenant de grandes quantités de α₂β complexe₂StTS a été stockée pendant 16 à 48 h à 4 °C jusqu’à ce que les cristaux jaunes précipitent. Les cristaux ont été lavés et largement dialysés contre différents tampons. Le complexe protéique a été recristallisé dans un tampon contenant du sulfate d’ammonium et dialysé^15. Bien que la cristallisation des protéines dépende des concentrations de protéines et de précipitants en solution, il est difficile de surveiller, de prédire et de reproduire la purification pour d’autres formes mutantes de α complexe₂β₂StTS en solution. Ce protocole a l’avantage de ne pas utiliser de méthodes chromatographiques; cependant, les inconvénients sont le long temps de purification nécessaire pour cristalliser, dialyser et recristalliser, nécessitant généralement 5 à 7 jours. Pour obtenir des cristaux adaptés à la collecte de données aux rayons X, plus de 600 conditions de cristallisation ont été évaluées à l’aide d’une combinaison et d’une variation de la concentration en protéines, de la température, des précipités (PEG 4 000, 6 000 et 8 000) et des additifs (CaCl_2,MnCl 2, ZnCl_2,cadavérine, putrescine, spermine ou spermidine)¹⁵. Les cristaux avaient une meilleure forme cristalline et se développaient plus rapidement dans des conditions contenant 12% de PEG 8 000 et 2 mM de spermine. La cristallisation était plus favorable à 25 °C plutôt qu’à 4, 30 ou 42 °C et a atteint les dimensions maximales en 3 jours^15. Plusieurs structures_cristallinesα 2 β₂StTS ont été rapportées à ce moment-là (1996-1999)^16,17,18,19,^20,21 et de nombreuses autres structures ont été publiées à ce jour.

Ici, l’objectif principal est de présenter des protocoles alternatifs pour purifier la tryptophane synthase et optimiser la cristallisation des protéines. Les présents travaux montrent des améliorations significatives pour purifier le type sauvage isolé α-sous-unité (αStTS), isolé β-sous-unité (βStTS), reconstitué α complexe₂β₂StTS à partir des sous-unités isolées, et le type sauvage et les formes mutantes du complexe α₂β₂StTS. Les avantages par rapport aux protocoles précédents sont considérables puisque le temps de purification a été considérablement réduit et que la cristallisation et la cryoprotection ont été optimisées. Les formes mutantes du complexe α₂β₂StTS conçues dans ce travail se sont cristallisées près de la même condition utilisée pour la forme de type sauvage. Cependant, une optimisation de la cristallisation fine était nécessaire pour obtenir de gros monocrissaux de qualité suffisante pour la détermination de la structure à une résolution proche de l’atome. À ce jour, 134 structures cristallines de tryptophane synthase sont déposées dans la banque de données sur les protéines (PDB), représentant respectivement 101, 31 et 2 structures cristallines pour les bactéries, les archées et les eucaryotes. Joliment, 73 structures appartiennent au typhimurium sérovar de S. enterica et 5 structures cristallines du complexe α₂β₂StTS ont des limites de résolution supérieures à 1,50 Angstroms. Sans surprise, 4 sur 5 ont été préparés dans notre groupe de recherche (PDB IDs:5CGQ à 1,18 Å, 4HT3 à 1,30 Å, 4HPJ à 1,45 Å, 6DZ4 à 1,45 Å résolution). Les structures cristallines raffinées de la forme mutante du complexe α₂β₂StTS devraient fournir de nouvelles informations sur le mécanisme et les rôles joués par les résidus d’acides aminés essentiels impliqués dans la synthèse du L-tryptophane.