PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Het tryptofaan synthase (TS) bi-enzym complex (α₂β₂) is een allosterisch enzym, dat de laatste twee stappen in de biosynthese van het aminozuur L-tryptofaan in bacteriën, planten en schimmels^1,2,3katalyseert. Bacterie Salmonella enterica serovar typhimurium (St) veroorzaakt een ernstige gastro-intestinale infectie bij mens en andere dieren. Aangezien mensen en hogere dieren geen TS hebben (EC 4.2.1.20), is de_remmingvan S. typhimurium α 2 β₂ TS-complex (α₂β₂StTS) onderzocht als een potentieel geneesmiddeldoel voor de behandeling van cryptosporidiose en tuberculose⁴, genitale en oculaire infecties⁵, en voor potentieel herbicidegebruik in de landbouw⁶. De α-subeenheid katalyseert het aldolytische decolleté van indool-3-glycerolfosfaat (IGP) tot glyceraldehyde-3-fosfaat (GAP) en indool, door de vorming van een indolytine tautomeer intermediair en vervolgens koolstof-koolstofbindingssplitsing om GAP en indool^3,6te produceren . De β-katalytische plaats bevat een pyridoxaal 5′-fosfaat (PLP) cofactormolecuul gebonden aan β-Lys87 via een Schiff-basis, dat functioneert als een elektronenzinking in de loop van de reacties op het enzym β-subeenheid^3,7. De β-site katalyseert de vervanging van de L-Serine side-chain hydroxyl door indool om L-tryptofaan en een watermolecuul in een PLP-afhankelijke reactie te geven. Sint TS dient als een reeds lang bestaand model voor het onderzoek naar substraatangeulering en allosterische communicatie binnen multi-enzymcomplexen^2,3. Bidirectionele allosterische communicatie tussen de α- en β-subeenheden van TS is noodzakelijk om de katalytische stappen te synchroniseren en indoolafgifte tijdens L-tryptofaansynthese te voorkomen³. Om deze inspanning uit te breiden, hebben we verschillende mutanten (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr en β-Ser377Ala) voorbereid door eenpuntsmutatie om te worden gebruikt bij verdere verkenningen van de relatie tussen enzymstructuur, mechanisme en functie op de katalytische locatie van de StTS β-subeenheid.

Gedetailleerd onderzoek naar het katalytische mechanisme van α₂β₂StTS is geïnitieerd door de onderzoeksgroep van Edith W. Miles. Vroege studies met inheemse Escherichia coli α₂β₂ TS-complex hebben zich gericht op de zuivering en karakterisering van het geïsoleerde α-subeenheid^8,9, geïsoleerde β-subeenheid^10,11 en de reconstitutie van het α₂β₂ TS-complex van de geïsoleerde subeenheden¹². De zuivering werd uitgevoerd door ammoniumsulfaatprecipitatie, monsterdialyse, DEAE-Sephadexchromatografie, dialyse en een tweede chromatografische ronde op een DEAE-Sephadex kolom¹². In een ander protocol werd de zuivering van hetzelfde complex verbeterd door het geklaarde cellysaat op een DEAE-Sephadex-kolom te laden, gevolgd door een chromatografische stap op een Sepharose 4B-kolom, ammoniumsulfaatprecipitatie en dialyse¹³. Beide zuiveringsprotocollen duren 4-5 dagen. Escherichia coli α₂β₂ TS complex gekristalliseerd, maar kristallen waren op dat moment niet geschikt voor röntgendiffractie.

In een nieuwe studie werden recombinante en wilde typevormen van S. typhimurium α₂β₂ TS-complex gezuiverd en gekristalliseerd^14,15. Het recombinant α₂β₂StTS complex werd overexpressie in E. coli stam CB149 met de pEBA-10 expressievector. Initiële kristallisatie en röntgendiffractiegegevensverzameling en analyse van de α₂β₂StTS-complex werden gerapporteerd¹⁴. Lange en dunne naalden zoals α₂β₂StTS-kristallen hebben echter de structurele studies aangetast. In een poging om betere röntgendiffractiegegevens te verzamelen, werd een ander zuiveringsprotocol beschreven om het wilde type en de mutante vormen van de α₂β₂StTS-complex¹⁵te zuiveren. Zuivering werd uitgevoerd met een eerste neerslag met spermine en PEG 8.000 in het geklaarde cellysaat en een groot omvangrijk neerslag werd verwijderd door centrifugeren. De supernatansfractie met grote hoeveelheden α₂β₂StTS-complex werd 16-48 uur bij 4 °C bewaard totdat gele kristallen neersloegen. Kristallen werden gewassen en uitgebreid gedialyseerd tegen verschillende buffers. Eiwitcomplex werd opnieuw gekeerd in buffer met ammoniumsulfaat en gedialyseerd¹⁵. Hoewel eiwitkristallisatie afhankelijk is van eiwit- en precipitante concentraties in oplossing, is het moeilijk om zuivering te controleren, te voorspellen en te reproduceren voor andere mutante vormen van α₂β₂StTS-complex in oplossing. Dit protocol heeft als voordeel dat het geen chromatografische methoden gebruikt; de nadelen zijn echter de lange zuiveringstijd die nodig is om te kristalliseren, dialyseren en recrystalliseren, meestal 5-7 dagen. Om kristallen te verkrijgen die geschikt zijn voor het verzamelen van röntgengegevens, werden meer dan 600 kristallisatieomstandigheden geëvalueerd met behulp van een combinatie en variatie van eiwitconcentratie, temperatuur, precipitanten (PEG 4.000, 6.000 en 8.000) en additieven (CaCl_2,MnCl_2,ZnCl_2,cadaverine, putrescine, spermine of spermidine)¹⁵. Kristallen hadden een betere kristallijne vorm en groeiden sneller in omstandigheden met 12% PEG 8.000 en 2 mM spermine. Kristallisatie was gunstiger bij 25 °C in plaats van bij 4, 30 of 42 °C en groeide binnen 3 dagen¹⁵uit tot maximale afmetingen. Verschillende α₂β₂StTS kristalstructuren werden gemeld op dat moment (1996-1999)^{16,17,18,19,20,21} en vele andere structuren zijn tot op heden gepubliceerd.

Hier is het belangrijkste doel om alternatieve protocollen te presenteren om tryptofaansynthase te zuiveren en eiwitkristallisatie te optimaliseren. Het huidige werk toont significante verbeteringen om het wilde type geïsoleerde α-subeenheid (αStTS), geïsoleerde β-subeenheid (βStTS) te zuiveren, gereconstitueerd α₂β₂StTS-complex van de geïsoleerde subeenheden, en wilde type en mutante vormen van de α₂β₂StTS complex. De voordelen ten opzichte van eerdere protocollen zijn aanzienlijk omdat de zuiveringstijd aanzienlijk werd verkort en kristallisatie en cryoprotectie werden geoptimaliseerd. Mutante vormen van α₂β₂StTS complex ontworpen in dit werk hebben gekristalliseerd in de buurt van dezelfde voorwaarde gebruikt voor de wild type vorm. Echter, fijne kristallisatie optimalisatie was nodig om grote enkele kristallen van voldoende kwaliteit te verkrijgen voor structuurbepaling bij bijna atoomresolutie. Tot op heden zijn er 134 tryptofaan synthase kristalstructuren afgezet in de Protein Data Bank (PDB), respectievelijk 101, 31 en 2 kristalstructuren voor bacteriën, archaea en eukaryote. Mooi, 73 structuren behoren tot S. enterica serovar typhimurium en 5 kristalstructuren van de α₂β₂StTS complex hebben resolutielimieten hoger dan 1,50 Angstroms. Het is niet verwonderlijk dat 4 van de 5 werden voorbereid in onze onderzoeksgroep (PDB ID’s: 5CGQ om 1,18 Å, 4HT3 om 1,30 Å, 4HPJ om 1,45 Å, 6DZ4 om 1,45 Å-resolutie). De verfijnde kristalstructuren van mutante vorm van α₂β₂StTS complex zullen naar verwachting nieuwe inzichten verschaffen in het mechanisme en de rollen die worden gespeeld door essentiële aminozuurresiduen die betrokken zijn bij de L-tryptofaansynthese.