PCR موتاجينيسيس، الاستنساخ، التعبير، بروتوكولات تنقية البروتين السريع وتبلور النوع البري وأشكال متحولة من التربتوفان سينتاس

مجمع التربتوفان synthase (TS) bienzyme (α₂β₂₎هو إنزيم الألوستيرون، تحفيز الخطوتين الأخيرتين في التمثيل الحيوي للأحماض الأمينية L-تريبتوفان في البكتيريا والنباتات والفطريات^1،2،3. بكتيريا السالمونيلا المعوية سيروفار تيفيموريوم (سانت)يسبب عدوى حادة في الجهاز الهضمي في البشر والحيوانات الأخرى. وبما أن البشر والحيوانات الأعلى ليس لديهم TS (EC 4.2.1.20) ، فإن تثبيط S. تم استكشاف typhimurium α₂β₂ TS مجمع (α₂β₂سانتTS) كهدف المخدرات المحتملة لعلاج cryptosporidiosis والسل⁴, التناسلية والعينية العدوى⁵, واستخدام مبيدات الأعشاب المحتملة في^{الزراعة 6}. α-subunit يحفز الانقسام الالدولية من الاندول-3-الجلسرين-فوسفات (IGP) إلى جليسيرالدهيدي-3-فوسفات (GAP) والانول, من خلال تشكيل الاندولينين tautomer وسيطة وبعد ذلك الكربون الكربون السندات الانقسام لإنتاج GAP والاتول^3,6. يحتوي الموقع β الحفاز على جزيء مساعد بيريدوكسال 5′-فوسفات (PLP) مرتبط β-Lys87 عبر قاعدة Schiff ، والذي يعمل كبالوعة إلكترون في سياق ردود الفعل في الإنزيم β-subunit^3,7. يحفز الموقع β استبدال الهيدروكسيل الجانبي L-Serine بالاندول لإعطاء L-Tryptophan وجزيء الماء في رد فعل يعتمد على PLP. سانت TS بمثابة نموذج طويل الأمد للتحقيق في توجيه الركيزة والاتصال التوستروني داخل المجمعات متعددة الانزيمات^2،3. الاتصال الالستيري ثنائي الاتجاه بين α β-subunits من TS ضروري لمزامنة الخطوات الحفازة ومنع إطلاق الندول أثناء توليف L-تريبتوفان³. لتوسيع هذا الجهد، قمنا بإعداد العديد من المسوخ (β-Gln114Ala، β-Lys167Thr، و β-Ser377Ala) عن طريق طفرة نقطة واحدة لاستخدامها في مزيد من الاستكشافات للعلاقة بين هيكل الإنزيم وآلية ووظيفة في الموقع الحفاز من سانتTS β subunit.

بدأت مجموعة البحث إديث دبليو مايلز البحث التفصيلي حول الآلية الحفازة α₂β₂StTS. وقد ركزت الدراسات المبكرة مع الأصلي Escherichia القولونية α₂β₂ TS المعقدة على تنقية وتوصيف وحدة α الفرعية^{المعزولة 8،9}، معزولة β وحدة فرعية^10،11 وإعادة تشكيل مجمع α₂β₂ TS من الوحدات الفرعية المعزولة¹². تم تنقية من قبل هطول الأمطار كبريتات الأمونيوم، وغسيل الكلى عينة، DEAE-Sephadex الكروماتوغرافيا، غسيل الكلى، وجولة كروماتوغرافية ثانية على عمود DEAE-Sephadex¹². في بروتوكول آخر ، تم تحسين تنقية نفس المجمع عن طريق تحميل lysate الخلية الموضحة على عمود DEAE-Sephadex تليها خطوة كروماتوغرافية على عمود سيفاروز 4B ، وهطول الأمطار كبريتات الأمونيوم وغسيل الكلى¹³. كلا البروتوكولين تنقية تستمر لمدة 4-5 أيام. Escherichia القولونية α₂β₂ TS معقدة تبلورت ولكن بلورات لم تكن مناسبة للانعراج الأشعة السينية في ذلك الوقت.

في دراسة جديدة، تم تنقية أشكال نوع المؤتلف والبرية من S. تيفيموريوم α₂β₂ TS المعقدة وتبلور^14،15. تم التعبير عن مركب α_{المؤتلف 2}β₂StTS بشكل مفرط في سلالة الإشريكية القولونية CB149 التي تحمل ناقل التعبير pEBA-10. تم الإبلاغ عن التبلور الأولي وجمع بيانات حيود الأشعة السينية وتحليل α₂β₂مجمع سانتTS^14. ومع ذلك، إبرة طويلة ورقيقة مثل α₂β₂بلوراتسانتTS ضعف الدراسات الهيكلية. في محاولة لجمع أفضل بيانات حيود الأشعة السينية، ووصف بروتوكول تنقية آخر لتنقية نوع البرية وأشكال متحولة من α₂β₂StTS مجمع¹⁵. تم إجراء تنقية مع هطول الأمطار الأولي باستخدام spermine و PEG 8000 في lysate الخلية الموضحة وإزالة عجل ضخمة كبيرة عن طريق الطرد المركزي. تم تخزين الكسر الفائق الذي يحتوي على كميات عالية من α₂β₂مجمع StTS لمدة 16-48 ساعة عند 4 درجات مئوية حتى عجلت بلورات صفراء. تم غسل البلورات و dialyzed على نطاق واسع ضد المخازن المؤقتة المختلفة. تم إعادة تبلور مجمع البروتين في العازلة التي تحتوي على كبريتات الأمونيوم و dialyzed¹⁵. على الرغم من أن تبلور البروتين يعتمد على البروتين وتركيزات متسرعة في الحل، فإنه من الصعب رصد والتنبؤ، وإعادة إنتاج تنقية لأشكال متحولة أخرى من α₂β₂StTS المعقدة في الحل. هذا البروتوكول له ميزة أنه لا يستخدم أي طرق كروماتوغرافية; ومع ذلك ، فإن المساوئ هي وقت التنقية الطويل اللازم لبلورة ، dialyze ، وإعادة التبلور ، وعادة ما تتطلب 5-7 أيام. للحصول على بلورات مناسبة لجمع بيانات الأشعة السينية، تم تقييم أكثر من 600 حالة تبلور باستخدام مزيج وتنوع تركيز البروتين ودرجة الحرارة والمهمات (PEG 4000 و6000 و8000)، والمواد المضافة (CaCl₂، MnCl₂، ZnCl₂، الجثث ، الرسين ، الحيوانات المنوية ، أو spermidine)¹⁵. بلورات كان شكل بلوري أفضل ونمت بشكل أسرع في الظروف التي تحتوي على 12٪ PEG 8000 و 2 mM spermine. كان التبلور أكثر ملاءمة عند 25 درجة مئوية بدلا من 4 أو 30 أو 42 درجة مئوية ونما إلى أقصى أبعاد في غضون 3 أيام¹⁵. تم الإبلاغ عن عدة α₂β₂StTS الهياكل الكريستالية في ذلك الوقت (1996-1999)^{16،17،18،19،20،21} والعديد من الهياكل الأخرى قد نشرت حتى الآن.

هنا, الغرض الرئيسي هو تقديم بروتوكولات بديلة لتنقية synthase التربتوفان وتحسين تبلور البروتين. يظهر هذا العمل تحسينات كبيرة لتنقية النوع البري المعزول α الفرعي (αStTS) ، β الفرعي المعزول (βStTS) ، المعاد تشكيله α₂β₂مجمعStTS من الوحدات الفرعية المعزولة ، والنوع البري والأشكال المتحولة α₂β₂StTS complex. المزايا على البروتوكولات السابقة كبيرة منذ تم تخفيض وقت تنقية بشكل كبير وتبلور و cryoprotection تم الأمثل. وقد تبلورت أشكال متحولة من α₂β₂مجمع سانتTS المهندسة في هذا العمل بالقرب من نفس الشرط المستخدمة لشكل نوع البرية. ومع ذلك ، كان من الضروري تحسين التبلور الدقيق للحصول على بلورات واحدة كبيرة ذات جودة كافية لتحديد الهيكل بدقة ذرية قريبة. حتى الآن، هناك 134 هياكل الكريستال التربتوفان synthase المودعة في بنك بيانات البروتين (PDB)، والمحاسبة 101، 31 و 2 هياكل الكريستال، على التوالي، للبكتيريا، archaea و eukaryote. لطيف، 73 هياكل تنتمي إلى S. enterica سيروفار تيفيموريوم و 5 هياكل الكريستال من α₂β₂StTS المعقدة لديها حدود القرار أعلى من 1.50 Angstroms. ليس من المستغرب، تم إعداد 4 من أصل 5 في مجموعتنا البحثية (PDB IDs:5CGQ في 1.18 Å، 4HT3 في 1.30 Å، 4HPJ في 1.45 Å، 6DZ4 في 1.45 Å القرار). ومن المتوقع أن توفر الهياكل البلورية المكررة لشكل متحول من α₂β₂StTS المعقد رؤى جديدة في الآلية والأدوار التي تلعبها بقايا الأحماض الأمينية الأساسية المشاركة في توليف L-تريبتوفان.