アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

血液供給手順は、生きている動物や人間の宿主を使用して行われなかったし、ロックフェラー大学の制度的動物の世話と使用委員会(IACUC)と機関審査委員会(IRB)によって設定されたガイドラインに準拠しました。 1. 食事の準備 この貪食刺激剤の調製、アデノシン5′-三リン酸 水性NaHCO3(分子量、MW = 84.006 g/mol)の25 mM溶液を調製してください。100 mLの25 mM NaHCO3の場合、210 mgのNaHCO3を体積フラスコに加え、2倍蒸留水(ddH2O)を合計100 mLに充填します。磁気攪拌棒を用いて、NaHCO3が溶解するまで溶液を十分に混合する。 25 mM NaHCO3 の水溶液中のATP二ナトリウム塩水和物(MW =551.14 g/mol)を200 mM ATPの最終濃度に再構成する。25 mM NaHCO3 バッファーで 200 mM ATP の合計体積 10 mL の場合、1.1 gの ATP 二ナトリウム塩ハイドレートをボリュームフラスコに加え、25 mM NaHCO3 バッファーを合計 10 mL に充てんします。磁気攪拌棒を使用して、すべてのATPが溶解するまで溶液を十分に混合する。注:ATPの加水分解を最小限に抑えるには、NaHCO3のような塩溶液によってバッファリングする必要があります。 ATP溶液をアリコートし、-20°Cで保存します。注:ATPのこのストックソリューションは、通常、6ヶ月ごとに新鮮に作られ、以下に記載されているすべての食事に使用されます。分解を防ぐために、ATPアリコートは、複数の凍結融解サイクルを経たり、他の食事成分と一緒に加熱したりしてはならない。 蛍光トレーサー溶液、フルオレセインの調製 フルオレセイン水溶液の2%(w/v)ストック溶液を調製する。総ストック液量10mLの場合、0.2gのフルオレセイン二ナトリウム塩を10mLのddH2Oと共に、室温でアルミニウム箔で包んだ15 mLの円錐管に混ぜます。このフルオレセインのストック溶液は、以下に記載されるすべての食事の希釈に使用することができる。注:フッ素は光に敏感であるため、アルミニウム箔で容器を包むことによって光への暴露を避けてください。 動物由来の血液食事の調製 すべての蚊に餌を与えるために必要な食事の数を計算します。各Glytubeは2mLの食事を持ち、約25個の蚊に餌を与えます。蛍光測定値の標準曲線を較正するために、追加の食事を1回準備します。特に記載がない限り、このセクションのすべてのステップでは、最終容積2 mLで1食を準備するために必要な試薬量について説明します。 動物由来の血液食事の場合、1.98〜2mLの脱脂羊の血液を15 mL円錐形チューブに移します(所望の血液量についてはステップ3.3を参照)。注:羊、モルモット、およびヒトを含む脊椎動物の血液の商業的に除細化された供給源は、13を使用することができる。使用前に、購入した血液が有効期限を過ぎていないことを確認し、特に血液成分の目に見える分離がある場合は、ボトルを反転させることによってそれをよく混ぜます。 最適な給餌のために、羊の血液を水浴中で45°Cに温めた後、ATPを1〜2mMの最終濃度に加えます。1 mM ATP の最終濃度の場合、200 mM ATP ストック溶液の 10 μL を 1.99 mL の事前温血と混合に加えます。2 mM ATP の最終濃度の場合、200 mM ATP ストックの 20 μL を 1.98 mL の事前温血に加え、混合します。ATPを添加しない場合は、2mLの除細化された羊の血液を温める。 その後、食事サイズの蛍光ベース定量を行う場合は、フルオレセイン溶液を0.002%の最終濃度(2μLの2%フルオレセインストックの2μL)に加えて食事総量2mLにします。フッ素を加えた量と同じ量の血液量を減らす。0.002%フルオレセインを含む最終食製剤の1 mLを保持し、基準標準曲線を生成する。蚊に届けられる食事と同じように、保持されたボリュームを扱う。実験の全期間を通して同じ光と温度条件に曝され、その後、配達された食事と一緒にこれを凍結します。 人工血液の食事の準備 すべての蚊に餌を与えるために必要な食事の数を計算します。各Glytubeは2mLの食事を持ち、約25個の蚊に餌を与えます。蛍光測定値の標準曲線を較正するために、追加の食事を1回準備します。特に記載がない限り、このセクションのすべてのステップでは、1つの2 mLの食事を調製するために必要な試薬量について説明します。 人工血液(コーガン(1990)22から適応)を調製するために、表1のように、まず400mM NaHCO3のストック溶液を作る。合計体積が400mM NaHCO 3(MW = 84.006 g/mol)の合計体積の場合、336mgのNaHCO3を体積フラスコに加え、2倍蒸留水(ddH2 O)を合計10mLに充てんします。 磁気攪拌棒を用いて、NaHCO3が溶解するまで溶液を十分に混合する。 人工血液のタンパク質成分については、400 mM NaHCO3の50mg/mLのγグロブリン、ddH2Oのヘモグロビン35mg/mL、ddH2O.2 O.タンパク質ストック溶液を4°Cで最大2ヶ月間保存できます。人工血液中の全ヒトタンパク質の最終濃度は125mg/mLです。これには、15 mg/mL γグロブリン、8 mg/mLヘモグロビン、および102 mg/mLアルブミンの最終濃度が含まれます。 2 mLの食事ごとに、600 μLのγグロブリン、460 μLのヘモグロビン、680 μLのアルブミン、および 250 μL の ddH2O を 表 1に記載されたストックソリューションから組み合わせます。食事を45°Cに温めるまで、200 mM ATPストック液の10 μLを加えてから、食事を提示する直前に待ちます。 その後、食事サイズの蛍光ベース定量を行う場合は、フルオレセイン溶液を0.002%の最終濃度(2μLの2%フルオレセインストックの2μL)に加えて食事総量2mLにします。ステップ4.4のddH2Oの体積を、フッ素添加と同じ量減らす。0.002%フルオレセインを含む最終食事製剤の少なくとも1 mLを保持し、基準標準曲線を生成する。蚊に届けられる食事と同じように、保持されたボリュームを扱う。実験の全期間を通して同じ光と温度条件に曝され、その後、配達された食事と一緒にこれを凍結します。 タンパク質フリー食前の調製(デュヴァルらより適応(2019)7)注:タンパク質フリーの生理食前の食事は、7、27、32の複数の方法で調製することができます。ここで提示される生理食前の食事は、上記の人工血液レシピのタンパク質フリーバージョンです。 すべての蚊に餌を与えるために必要な食事の数を計算します。各Glytubeは2mLの食事を保持し、約25個の蚊に餌を与え、蛍光測定のための標準曲線を較正するために1つの追加の食事を準備する。特に記載がない限り、このセクションのすべてのステップでは、1つの2 mLの食事を調製するために必要な試薬量について説明します。 生理食前の食事を準備するには、400 mM NaHCO3のストック溶液を作ります。合計体積が400 mM NaHCO 3(MW = 84.006 g/mol)の合計体積の場合、336 mgのNaHCO3を体積フラスコに加え、ddH2Oで10mLの合計体積に充満します。磁気攪拌棒を用いて、NaHCO3が溶解するまで溶液を十分に混合する。 2 mLの食事ごとに、1.39 mLのddH2O.と400 mM NaHCO3の15 mL円錐形チューブ600 μLに組み合わせて、食事が水浴で45°Cに温まるまで200mM ATPストック溶液の10 μLを加えます。 その後、食事サイズの蛍光ベース定量を行う場合は、フルオレセイン溶液を0.002%の最終濃度(2μLの2%フルオレセインストックの2μL)の食事量合計2mLに加えます。ステップ5.3のddH2Oの体積を、フッ素添加と同じ量減らす。0.002%フルオレセインを含む最終食事製剤の少なくとも1 mLを保持し、基準標準曲線を生成する。蚊に届けられる食事と同じように、保持されたボリュームを扱う。実験の全期間を通して同じ光と温度条件に曝され、その後、配達された食事と一緒にこれを凍結します。 2. 蚊への食事配達 餌付け用の蚊容器の設置注:蚊は、次の基準を満たしている限り、様々な容器に供給することができます。コンテナは蚊が飛び回るのに十分な大きさですが、蚊がメッシュ表面を見つけて餌を与え始めるほど大きくないことを確認してください。コンテナを覆うために使用されるメッシュは、材料や穴のサイズが異なる場合があります。穴は、メスの蚊のススタイリングが突き抜けるのに十分な大きさでなければなりませんが、蚊が逃げるほど大きくはありません。メッシュが張り合いになるようにしっかりと固定し、Glytubeは給餌期間を通して表面に安定して休むことができます。 例えば容器(図1)は、変性946mL(32オンス)高密度ポリエチレン(HDPE)プラスチックバケットです。このセットアップを再現するには、カミソリの刃を使用して、バケット蓋の直径〜10cmの中央の穴を切断します。蚊による占領のための容器を組み立てるには、バケツの上に白い0.8mmポリエステル蚊網の〜400 cm2 平方片を固定し、穿穿蓋をしっかりと押し下げてしっかりとスナップします。 少なくとも3日間のエローション後の雌の蚊を集めて、血液を与えるのに十分な成熟を確保する。最適な供給率は、7日後に33. メスの蚊を容器に入れ、メッシュで覆います。コンテナに蚊が密集している場合は、使用するGlytubesの数を増やします。最適な給餌は、〜25個の蚊/Glytubeで達成されます。これにより、供給膜へのアクセスの競争が減少します。 食事を提供されない未供給の蚊の対照群を脇に置きます。重量測定プロトコルでは、未供給の群を別々に計量し、この重量を使用して食事に与えた実験群の体重増加を推定する。蛍光ベースの定量プロトコルでは、標準的な曲線計算と陰性制御のために、未供給の蚊群を井戸に追加します。実験群のベースライン蚊組織自己蛍光と一致させるために、標準的な曲線および陰性対照ウェルに未供給の蚊が含まれていることを確認する。 Glytubeの構築と設定(コスタ・ダ・シルバらから適応(2013)20) 図1に示すように、熱源を発生させるため、50mLの円錐チューブを100%グリセロールの40mLで満たします。5 cm×5 cmパラフィルムで開いた円錐形の管を密封し、5 cm×5 cmのパラフィルムの追加部分で漏出の可能性を最小にする。必要に応じて、パラフィルムは、ゴムバンドを使用して所定の位置に保持することができます。穴や隙間がないことを確認するために、チューブを反転します。 食事の配達装置を作成するには、鋭いカミソリの刃を使用して円錐管のねじキャップに直径2.5cmの中心の穴を切断するか、より良い一貫性のために、旋回します。5cm×5cmのパラフィルムを均等に伸ばして、サイズが約2倍になるようにします。パラフィルムは、蚊が簡単にそれを突き刺すことができるほど薄くする必要がありますが、漏れはありません。ネジキャップの外面にシールを付けて穴を完全に覆い、キャップを脇に置きます。注:Glytubeへの魅力を高めるために、パラフィルムを伸ばす前に、化粧品を塗布していない人間の皮膚のパッチに優しくこすり、穴が開かないことに注意して、人間の匂いを香水にします。これは、実験が蚊が食事に近づくのに必要な感覚的手がかりを調査することを目的としていない場合にお勧めします。 グリセロールの密閉チューブと食事(ATPを除くすべての成分)を42〜45°Cの水浴で少なくとも15分間加熱します。ATP を事前に加熱しないでください。実験を開始する直前に追加してください。 温めた食事と渦にATPを徹底的に加えます。ねじキャップの内側の部屋に温めた食事のピペット2 mLを、その中に、逆、温めた、グリセロール充填50 mLの円錐管を穏やかに入れます。グリセロールで満たされたチューブに食事でキャップを部分的にねじ込む – ちょうど食事やグリセロールの漏れを防ぐために十分。注意:使用される食事量は1 mLから2.5 mLの範囲です。食事が不足しているか高価な化合物を提供するために使用される場合は、より低いボリュームが特に有用である可能性があります。食事が周囲温度に冷やさなくなり、最大摂食の可能性を減らすために、このステップで迅速に作業することが重要です。冷却速度は、これらのステップが実施される部屋の周囲温度に依存しますが、通常は25°Cで5分以内に完了する必要があります。 組み立てたGlytubeを蚊の容器の上に置き、蚊が少なくとも15分間餌を与え、最大の給餌率を達成できるようにします。 最適な給餌のために、CO2パッドを備えたチャンバー内に蚊容器を入れ、食事を届ける前に25〜28°Cおよび70〜80%の湿度で少なくとも15分の順応を可能にする。ここで使用されるアッセイチャンバーは、以前に公開されたセットアップ16のシンプルで低コストの変更です。それは取り外し可能なふたが付いている36 cm L×31 cm Wの31 cm W×32 cm Hの半透明のポリプロピレンの貯蔵箱を使用する。チャンバー壁に作られた直径1.5 cmの穴はシリコーン管を通してCO2の配達を可能にする。CO2拡散パッドは、試験中にチャンバ雰囲気を条件として浄化空気とCO2の送達のために蓋の内側中央に貼り付けられている。注:蚊が膜フィーダーに引き付けられるように、ホストキュー(熱とCO2、オプションのホスト臭16)が存在することを確認してください。蚊がGlytubeの下に混雑していない場合は、CO2 が適切に配信され、食事とGlytubeが十分に暖かであることを確認してください。外部CO2 ソースが利用できない場合、CO2 は、吐き出された人間の息のパフを介して送達することができます。 給餌後、グリチューブキャップはバイオハザード廃棄物として廃棄するか、低い割合の漂白剤溶液に浸漬し、水に完全にすすい込んだ後に再利用することができます。 3. 消費される食事の定量化 さらなる実験に使用される蚊の重量を量る注:食事の大きさを定量化するために蚊の重量を量ることは、彼らがさらなるライブ実験に使用することを可能にしますが、この方法は5蚊のグループから体重測定を行う必要があります。個々の蚊の重さは、ほとんどの実験室のバランスを使用して正確に測定することは困難であるため、個々の食事のサイズの変動は、重量を測定することによって容易に定量することはできません。体重計は、女性が目に見えて食事に夢中になる状況にのみ推奨されます。 冷たい麻酔は、容器を4°Cの冷たい部屋に移すか、氷の上に置くことによって蚊を麻酔します。 未供給のコホート(すなわち、食事を提供されなかった蚊)から5人の女性のグループを計量し、「前食い」体重の推定値としてその平均体重を計算する。未供給の蚊の平均重量は、遺伝子型、性別、および飼育条件に依存する。スクロースへのアドリビタムアクセスで飼育された未供給の雌のAe.aegypti蚊は、通常、それぞれ約2mgの重量を量る。 実験コホート(すなわち、食事を提供された蚊)から、雌を「食べ物」に分類し、目7で観察可能な腹部の膨満感に基づいて杭を「与えられない」と「与えられない」。「餌を与えられた」と「供給されていない」杭のそれぞれを、計量のために5つの蚊のグループに分けます。5の各グループ内の蚊は、グループ体重測定を行うのと同じ実験コホートから誘導されるべきである。実験群の「供給」および「供給されない」杭のそれぞれから女性あたりの平均重量を計算する。 終点分析のための蛍光測定7,27,34注:さらなる生きた実験に必要でなくなった個々の蚊から正確な食事サイズの測定を得るために、蚊と0.002%フルオレセインを含む残りの1mLを、授乳直後に-20°Cで保存してください。ここで実験を一時停止できます。この方法の概要は、 図 2.基準標準曲線を生成するには、蚊の実験群に提供された0.002%フルオレセインを含む同じ食事の連続希釈を調製する。8つの標準曲線ソリューションの合計があります。これらの各ソリューションでは、0.002%フルオレセインを含む食事の最終量は5になります。 2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125、または0 μL、およびそれぞれ1xリン酸緩衝生理食塩分(PBS)で100μL(例えば、0.002%のフルオルセインを含む食事の5μL)になります。 標準曲線の最初の溶液を作るために、0.002%のフルオレセインを含む50 μLの食事を950 μLの1x PBSと渦を徹底的に加えます(最終容積:0.002%のフルオレセインを含む5 μLの食事を95 μLの1x PBSで5μL)。標準のカーブソリューションの残りの部分を作るためには、前のチューブから500 μLを取り出し、それを500 μLの1x PBSを含む新しいチューブに加えることによって、各ステップに対して2倍希釈を行います。次の2倍希釈を準備する前にボルテックスをよく。 標準曲線の標準曲線を生成するために使用されるウェルを準備するために、96ウェルPCRプレートの第1列の各8つのウェルに標準曲線溶液のピペット100 μLを準備します。プレートの最初の列に同じ8つの井戸のそれぞれに1つの未供給のコントロール蚊を追加します。複製測定のためにプレートの 2 番目の列で繰り返します。注:実験グループが異なる食事タイプを提供される場合は、食事タイプごとに別の基準標準曲線を用意する必要があります。 1x PBSの100 μLを残りの各ウェルに加えて、未供給の制御および実験グループに対して十分に加えます。ビーズミルホモジナイザーまたはボルテックスを使用してその後のステップで組織が破壊される場合は、各ウェルに1つの3mmホウケイ酸ホウケイ酸固体ガラスビーズを加えます。 陰性対照として、プレートの次の2列の各井戸に1つの未添加の蚊を加える。このグループで測定された蛍光は、組織の自己蛍光を考慮したベースラインカットオフを設定し、実験群の蚊が食事に餌を与えたかどうかを判断するために使用されます。 食事を提供された実験グループの残りの井戸に井戸あたり1蚊を加えます。 プレートを慎重に密封し、手動研削によって組織を破壊する。腹部は、食事を解放するために完全に均質化する必要があります。組織を破壊する方法には、3mmホウケイ酸固体ガラスビーズ(30秒間30Hz)を用いたビーズミルホモジナイザー、3mmホウケイ酸固体ガラスビーズ付きのボルテックスミキサー、ビーズなしの害虫粉砕機などがあります。 2000 rpm でプレートを遠心して、1~2 分間、リセートを回収します。 各井戸に180 μLの1x PBSを入した黒い96ウェルプレートを用意します。 1x PBS 180 μL で 20 μL の溶液を各ウェルに移し、混合します。可能な場合は、速度を向上させ、一貫性を向上させるため、このステップでマルチチャンネルピペットを使用します。 485/520励起/放出チャネルのプレートリーダーを使用して、各ウェルの蛍光強度を測定します。対応する蛍光強度測定に対して既知の食事量をプロットすることにより、基準標準曲線を生成する。 生成された基準標準曲線を用いて、各実験群の蚊によって摂取された食事量を推定する。各実験群の個々の蛍光強度読み取りから、未供給の蚊の陰性対照群の平均蛍光強度測定値を差し引いて、ベースライン組織自己蛍光を補正する。