Purificación de tubulina con modificaciones posttranslacionales controladas e isotipos de fuentes limitadas por ciclos de polimerización-despolimerización

Los microtúbulos desempeñan un papel crítico en muchos procesos celulares. Dan a las células su forma, construyen husillos meioticos y mitoticos para la segregación cromosómica, y sirven como pistas para el transporte intracelular. Para realizar estas diversas funciones, los microtúbulos se organizan de diferentes maneras. Una de las preguntas intrigantes en el campo es entender los mecanismos moleculares que permiten que los microtúbulos conservados estructural y evolutivamente se adapten a esta plétora de organizaciones y funciones. Un mecanismo potencial es la diversificación de los microtúbulos, que se define por el concepto conocido como el ‘código de tubulina’^1,2,3. El código de tubulina incluye dos componentes principales: la incorporación diferencial de productos genéticos de α y β-tubulina (isotipos de tubulina) en los microtúbulos y modificaciones posttransacionales de tubulina (PTM).

Desde la década de 1970, los experimentos de reconstitución in vitro, combinados con técnicas de microscopía ligera en evolución, han allanado el camino para importantes descubrimientos sobre las propiedades de los microtúbulos: inestabilidad dinámica⁴ y cinta de correr^5,y sus otros mecanismos y funciones^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.} Casi todos los experimentos in vitro realizados hasta ahora se han basado en la tubulina purificada del tejido cerebral utilizando ciclos repetidos de polimerización y despolimerización^16,17. Aunque la purificación del tejido cerebral confiere la ventaja de obtener tubulina de alta calidad en grandes cantidades (generalmente cantidades de gramo), un inconveniente importante es la heterogeneidad ya que la tubulina purificada del tejido cerebral es una mezcla de diferentes isotipos de tubulina y se enriquece con muchos PTMs de tubulina. Esta heterogeneidad hace imposible delinear el papel de un PTM de tubulina en particular o isotipo en el control de propiedades y funciones de microtúbulos. Por lo tanto, producir tubulina competente para el montaje con PTMs de tubulina controlados y composición homogénea del isotipo es esencial para abordar los mecanismos moleculares del código de tubulina.

Recientemente, se ha desarrollado un enfoque para purificar la tubulina mediante cromatografía de afinidad utilizando el dominio tog (gensobreexpresado tumoral) de levadura Stu2p. En este método, la tubulina en liatos crudos de células o tejidos se pasa a través de una columna donde se une al dominio TOG inmovilizado por matriz, lo que permite el análisis de toda la piscina de tubulina de una muestra dada, incluso muy pequeña. Un enfoque largamente esperado para purificar la tubulina recombinante también ha sido descrito en los últimos años. Se basa en el sistema baculovirus, en el que se expresa un vector bi-cistrónico que contiene genes α y β-tubulina en las células de insectos^19. Sin embargo, este método es muy engorroso y lento y por lo tanto se utiliza principalmente para estudiar el impacto de las mutaciones de tubulina²⁰ y isotipos de tubulina^21,22,23 in vitro.

En el protocolo actual, describimos un método que utiliza el enfoque de polimerización-despolimerización bien establecido y ampliamente utilizado como un plan para generar tubulina con diferentes niveles de modificación ya sea a partir de líneas celulares o del tejido cerebral del ratón^24. En este procedimiento, la tubulina se ciclo entre el soluble (trobulina dimer a 4 °C) y forma polimerizada (microtúbulos a 30 °C en presencia de guanosina 5′-tripfosfato [GTP]). Cada forma se separa a través de sucesivos pasos de centrifugación: los atenuadores de tubulina permanecerán en el sobrenadante después de un giro frío (4 °C), mientras que los microtúbulos se peletizarán a 30 °C. Además, se lleva a cabo un paso de polimerización a alta concentración de piperazina-N,N′-bis(ácido etanoesulfónico) (PIPES), que permite la eliminación de proteínas asociadas a microtúbulos de los microtúbulos y, por lo tanto, de la tubulina finalmente purificada. La tubulina purificada a partir de células HeLa S3 cultivadas como cultivos de suspensión o adherentes está virtualmente libre de cualquier PTM de tubulina y se ha utilizado en experimentos recientes de reconstitución in vitro^25,26,27,28. Hemos adaptado aún más el método para purificar la tubulina de cerebros de ratón único, que se pueden utilizar para un gran número de modelos de ratón con cambios en isotipos de tubulina y PTM.

En el protocolo, primero describimos la generación del material de origen (masa celular o tejido cerebral), su lisis(Figura 1A),seguido de los sucesivos pasos de polimerización y despolimerización de la tubulina para purificar la tubulina (Figura 1B). Además, describimos el proceso para evaluar la pureza(Figura 2A,B)y la cantidad (Figura 3A,B) de la tubulina purificada. El método se puede adaptar para producir tubulina enriquecida con un PTM seleccionado mediante la sobreexpresión de una enzima modificadora en las células antes de la purificación de la tubulina (Figura 4B). Alternativamente, las enzimas modificadores de la tubulina se pueden agregar a la tubulina durante el proceso de purificación. Por último, podemos purificar la tubulina carente de isotipos específicos o PTMs de los cerebros de ratones deficientes en las correspondientes enzimas modificadores de la tubulina (Figura 4B)²⁹.

El método que describimos aquí tiene dos ventajas principales: (i) permite la producción de cantidades suficientemente grandes de tubulina en un tiempo relativamente corto, y (ii) genera tubulina pura de alta calidad, con composición isotipo de tubulina específica o PTM. En el video asociado de este manuscrito, destacamos algunos de los pasos críticos involucrados en este procedimiento.