Purificazione della tubulina con modifiche e isotipi posttraslazionali controllati da fonti limitate mediante cicli di polimerizzazione-depolimerizzazione

I microtubuli svolgono un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Danno alle cellule la loro forma, costruiscono mandrini meiotici e mitotici per la segregazione cromosomica e fungono da binari per il trasporto intracellulare. Per svolgere queste diverse funzioni, i microtubuli si organizzano in modi diversi. Una delle domande intriganti sul campo è comprendere i meccanismi molecolari che permettono ai microtubuli conservati strutturalmente ed evolutivamente di adattarsi a questa pletora di organizzazioni e funzioni. Un meccanismo potenziale è la diversificazione dei microtubuli, definita dal concetto noto come “codice di tubulina”^1,2,3. Il codice della tubulina comprende due componenti principali: l’incorporazione differenziale dei prodotti gene α e β-tubulina (isotipi di tubulina) nei microtubuli e le modifiche posttraslazionali della tubulina (PTM).

Dagli anni ’70, gli esperimenti di ricostituzione in vitro, combinati con tecniche di microscopia ottica in evoluzione, hanno aperto la strada a importanti scoperte sulle proprietà dei microtubuli: instabilità dinamica⁴ e tapis roulant^5,e i loro altri^{meccanismi e funzioni 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Quasi tutti gli esperimenti in vitro eseguiti finora sono stati basati su tubulina purificata dal tessuto cerebrale utilizzando cicli ripetuti di polimerizzazione e depolimerizzazione^16,17. Sebbene la purificazione dal tessuto cerebrale conferisa il vantaggio di ottenere tubulina di alta qualità in grandi quantità (di solito quantità di grammi), uno svantaggio importante è l’eterogeneità come tubulina purificata dal tessuto cerebrale è una miscela di diversi isotipi di tubulina ed è arricchita con molte PTT di tubulina. Questa eterogeneità rende impossibile delineare il ruolo di un particolare PTM o isotipo di tubulina nel controllo delle proprietà e delle funzioni dei microtubuli. Pertanto, la produzione di tubulina competente per l’assemblaggio con PTT di tubulina controllata e composizione omogenea dell’isotipo è essenziale per affrontare i meccanismi molecolari del codice della tubulina.

Recentemente, è stato sviluppato un approccio per purificare la tubulina mediante cromatografia di affinità utilizzando il dominio TOG legante i microtubuli (gene sopraespresso tumorale) del lievito Stu2p¹⁸. In questo metodo, la tubulina nei lisati grezzi di cellule o tessuti viene passata attraverso una colonna in cui si lega al dominio TOG immobilizzato dalla matrice, che consente l’analisi dell’intero pool di tubulina di un dato campione, anche molto piccolo. Negli ultimi anni è stato descritto anche un approccio tanto atteso per purificare la tubulina ricombinante. Si basa sul sistema baculovirus, in cui un vettore bi-cistronico contenente geni α- e β-tubulina è espresso nelle cellule degli^{insetti 19}. Tuttavia, questo metodo è molto ingombrante e dispendioso in termini di tempo ed è quindi utilizzato principalmente per studiare l’impatto delle mutazioni della tubulina²⁰ e degli isotipi di tubulina^21,22,23 in vitro.

Nel protocollo attuale, descriviamo un metodo che utilizza il consolidato e ampiamente utilizzato approccio di polimerizzazione-depolimerizzazione come progetto per generare tubulina con diversi livelli di modifica sia dalle linee cellulari che dal tessuto cerebrale del topo²⁴. In questa procedura, la tubulina viene pedalata tra la forma solubile (dimero di tubulina a 4 °C) e polimerizzata (microtubulo a 30 °C in presenza di guanosina 5′-trifosfato [GTP]). Ogni forma è separata attraverso fasi successive di centrifugazione: i dimeri di tubulina rimarranno nel supernatante dopo uno spin freddo (4 °C), mentre i microtubuli saranno pellettati a 30 °C. Inoltre, una fase di polimerizzazione viene effettuata ad alta concentrazione di piperazina-N,N′-bis(acido 2-etanosolfonico) (PIPES), che consente la rimozione delle proteine associate ai microtubuli dai microtubuli e quindi dalla tubulina infine purificata. La tubulina purificata dalle cellule HeLa S3 coltivate come colture sospese o aderenti è praticamente priva di qualsiasi PTM di tubulina ed è stata utilizzata in recenti esperimenti di ricostituzione in vitro^25,26,27,28. Abbiamo ulteriormente adattato il metodo per purificare la tubulina dal cervello di un singolo topo, che può essere utilizzato per un gran numero di modelli di topi con cambiamenti negli isotipi di tubulina e nelle PTT.

Nel protocollo, descriviamo prima la generazione del materiale sorgente (massa cellulare o tessuto cerebrale), la sua lisi (Figura 1A), seguita dai successivi passaggi di polimerizzazione della tubulina e depolimerizzazione per purificare la tubulina (Figura 1B). Descriviamo inoltre il processo di valutazione della purezza(figura 2A,B)e della quantità(figura 3A,B)della tubulina purificata. Il metodo può essere adattato per produrre tubulina arricchita con un PTM selezionato sovraesprimendo un enzima modificante nelle cellule prima della purificazione della tubulina (Figura 4B). In alternativa, gli enzimi che modificano la tubulina possono essere aggiunti alla tubulina durante il processo di purificazione. Infine, possiamo purificare la tubulina priva di isotipi specifici o PTM dal cervello di topi carenti nei corrispondenti enzimi che modificano la tubulina (Figura 4B)²⁹.

Il metodo che descriviamo qui ha due vantaggi principali: (i) consente la produzione di quantità sufficientemente grandi di tubulina in un tempo relativamente breve, e (ii) genera tubulina pura di alta qualità, con una specifica composizione di isotipo di tubulina o PTT. Nel video associato di questo manoscritto, evidenziamo alcuni dei passaggi critici coinvolti in questa procedura.