Reinigung von Tubulin mit kontrollierten posttranslationalen Modifikationen und Isotypen aus begrenzten Quellen durch Polymerisations-Depolymerisationszyklen

Mikrotubuli spielen in vielen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle. Sie geben Zellen ihre Form, bauen meiotische und mitotische Spindeln für die Chromosomensegregation und dienen als Spuren für den intrazellulären Transport. Um diese vielfältigen Funktionen auszuführen, organisieren sich Mikrotubuli auf unterschiedliche Weise. Eine der faszinierendsten Fragen auf diesem Gebiet ist es, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die es den strukturell und evolutionär konservierten Mikrotubuli ermöglichen, sich an diese Fülle von Organisationen und Funktionen anzupassen. Ein potenzieller Mechanismus ist die Diversifizierung der Mikrotubuli, die durch das Konzept definiert wird, das als “Tubulin-Code”^1,2,3” bekannt ist. Der Tubulin-Code umfasst zwei Hauptkomponenten: die Differentialintegration von α- und β-Tubulin-Genprodukten (Tubulin-Isotypen) in die Mikrotubuli und Tubulin-Posttranslationalmodifikationen (PTMs).

Seit den 1970er Jahren haben In-vitro-Rekonstitutionsexperimente, kombiniert mit sich entwickelnden Lichtmikroskopie-Techniken, den Weg für wichtige Entdeckungen über die Eigenschaften von Mikrotubuli geebnet: dynamische Instabilität⁴ und Laufband^5,und ihre anderen Mechanismen und Funktionen^{6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Fast alle bisher durchgeführten In-vitro-Experimente basierten auf Tubulin, das aus Hirngewebe mit wiederholten Zyklen der Polymerisation und Depolymerisation^16,17gereinigt wurde. Obwohl die Reinigung aus dem Hirngewebe den Vorteil der Gewinnung von hochwertigem Tubulin in großen Mengen (in der Regel Grammmengen) verleiht, ist ein wichtiger Nachteil die Heterogenität, da Tubulin, das aus Hirngewebe gereinigt wird, eine Mischung aus verschiedenen Tubulin-Isotypen ist und mit vielen Tubulin-PTMs angereichert ist. Diese Heterogenität macht es unmöglich, die Rolle eines bestimmten Tubulin-PTM oder Isotyps bei der Kontrolle von Mikrotubuli-Eigenschaften und -Funktionen abzustecken. Daher ist die Herstellung von Montage-kompetentem Tubulin mit kontrollierten Tubulin-PTMs und homogener Isotypzusammensetzung unerlässlich, um die molekularen Mechanismen des Tubulincodes anzugehen.

Kürzlich wurde ein Ansatz zur Reinigung von Tubulin durch Affinitätschromatographie mit der mikrotubulienbindenden TOG-Domäne (Tumor-überexprimiertes Gen) der Hefe Stu2p^entwickelt. Bei dieser Methode wird Tubulin in rohen Lysaten von Zellen oder Geweben durch eine Säule geleitet, wo es an die matriximmobilisierte TOG-Domäne bindet, die die Analyse des gesamten Tubulinpools einer bestimmten, sogar sehr kleinen Probe ermöglicht. Ein lang erwarteter Ansatz zur Reinigung des rekombinanten Tubulins wurde in den letzten Jahren ebenfalls beschrieben. Es basiert auf dem Baculovirus-System, in dem ein bi-cistronischer Vektor, der α- und β-Tubulin-Gene enthält, in Insektenzellen¹⁹exprimiert wird. Diese Methode ist jedoch sehr umständlich und zeitaufwändig und wird daher hauptsächlich zur Untersuchung der Auswirkungen der Tubulinmutationen²⁰ und der Tubulin-Isotypen^21,22,23 in vitro verwendet.

Im aktuellen Protokoll beschreiben wir eine Methode, die den etablierten und weit verbreiteten Polymerisations-Depolymerisationsansatz als Blaupause verwendet, um Tubulin mit unterschiedlichen Modifikationsstufen entweder aus Zelllinien oder aus Maushirngewebe zu erzeugen²⁴. Bei diesem Verfahren wird Tubulin zwischen dem löslichen (Tubulin-Dimer bei 4 °C) und der polymerisierten Form (Mikrotubuli bei 30 °C in Gegenwart von Guanosin 5′-Triphosphat [GTP]) geradelt. Jede Form wird durch aufeinander folgende Zentrifugationsschritte getrennt: Tubulin-Dimere bleiben nach einer Erkältung (4 °C) im Überstand, während Mikrotubuli bei 30 °C pelletiert werden. Darüber hinaus wird ein Polymerisationsschritt bei hoherPiperazin-N-Bis(2-Ethansulfonsäure) (PIPES) Konzentration durchgeführt, die die Entfernung von mikrotubuli-assoziierten Proteinen aus den Mikrotubuli und damit aus dem schließlich gereinigten Tubuli ermöglicht. Tubulin gereinigt aus HeLa S3 Zellen als Suspension oder anhantibe Kulturen gewachsen ist praktisch frei von jedem Tubulin PTM und wurde in den jüngsten In-vitro-Rekonstitutionsexperimente^25,26,27,28verwendet. Wir haben die Methode zur Reinigung von Tubulin von einzelnen Mausgehirnen weiter angepasst, die für eine große Anzahl von Mausmodellen mit Änderungen in Tubulin-Isotypen und PTMs verwendet werden können.

Im Protokoll beschreiben wir zunächst die Erzeugung des Ausgangsmaterials (Zellmasse oder Hirngewebe), seine Lyse (Abbildung 1A), gefolgt von den aufeinanderfolgenden Schritten der Tubulinpolymerisation und Depolymerisation zur Reinigung des Tubulins (Abbildung 1B). Wir beschreiben ferner das Verfahren zur Beurteilung der Reinheit (Abbildung 2A,B) und der Menge (Abbildung 3A,B) des gereinigten Tubulins. Das Verfahren kann angepasst werden, um Tubulin zu produzieren, das mit einem ausgewählten PTM angereichert ist, indem ein modifizierendes Enzym in Zellen vor der Tubulinreinigung überexzessiert wird (Abbildung 4B). Alternativ können Tubulin-modifizierende Enzyme während des Reinigungsprozesses dem Tubulizuz hinzugefügt werden. Schließlich können wir Tubulin ohne spezifische Isotypen oder PTMs aus dem Gehirn von Mäusen reinigen, die einen Mangel an den entsprechenden Tubulin-modifizierenden Enzymen aufweisen (Abbildung 4B)²⁹.

Die Methode, die wir hier beschreiben, hat zwei Hauptvorteile: (i) es ermöglicht die Produktion ausreichend großer Mengen Tubulin in relativ kurzer Zeit, und (ii) es erzeugt hochwertiges, reines Tubulin, entweder mit spezifischer Tubulin-Isotypzusammensetzung oder PTMs. Im zugehörigen Video dieses Manuskripts heben wir einige der kritischen Schritte dieses Verfahrens hervor.