Purification de la tubuline avec modifications posttranslationnelles contrôlées et isotypes à partir de sources limitées par des cycles de polymérisation et de dépolymérisation

Les microtubules jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus cellulaires. Ils donnent aux cellules leur forme, construisent des fuseaux méiotiques et mitotiques pour la ségrégation chromosomique, et servent de pistes pour le transport intracellulaire. Pour remplir ces diverses fonctions, les microtubules s’organisent de différentes manières. L’une des questions intrigantes sur le terrain est de comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent aux microtubules structurellement et évolutionnistes de s’adapter à cette pléthore d’organisations et de fonctions. Un mécanisme potentiel est la diversification des microtubules, qui est définie par le concept connu sous le nom de « code tubulin »^1,2,3. Le code de la tubuline comprend deux composantes principales : l’incorporation différentielle de produits géniques α et β-tubulin (isotypes tubulaires) dans les microtubules et les modifications posttranslationnelles à la tubuline (MNP).

Depuis les années 1970, les expériences de reconstitution in vitro, combinées à l’évolution des techniques de microscopie légère, ont ouvert la voie à d’importantes découvertes sur les propriétés des microtubules : instabilité^{dynamique 4} et tapis^{roulant 5}, et leurs autres mécanismes^{et fonctions 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}. Presque toutes les expériences in vitro réalisées jusqu’ici ont été basées sur la tubuline purifiée du tissu cérébral utilisant des cycles répétés de polymérisation et de dpolymérisation^16,17. Bien que la purification du tissu cérébral confère l’avantage d’obtenir la tubuline de haute qualité en grandes quantités (généralement des quantités de gramme), un inconvénient important est l’hétérogénéité que la tubuline purifiée à partir du tissu cérébral est un mélange de différents isotypes de tubuline et est enrichi avec de nombreux PTMs tubulin. Cette hétérogénéité rend impossible la délimiture du rôle d’un PTM ou d’un isotype de tubuline particulier dans le contrôle des propriétés et des fonctions des microtubules. Ainsi, la production d’une tubuline compétente en assemblage avec des MNP tubulaires contrôlés et une composition homogène d’isotype est essentielle pour traiter les mécanismes moléculaires du code de la tubuline.

Récemment, une approche pour purifier la tubuline par chromatographie d’affinité utilisant le domaine de TOG microtubule-liant (gène tumeur-surexprimé) de levure Stu2p a été^{développée 18.} Dans cette méthode, la tubuline dans les lysates bruts des cellules ou des tissus est passée à travers une colonne où elle se lie au domaine TOG immobilisé par matrice, ce qui permet l’analyse de l’ensemble du pool de tubulines d’un échantillon donné, voire très petit. Une approche attendue depuis longtemps pour purifier la tubuline recombinante a également été décrite ces dernières années. Il est basé sur le système de baculovirus, dans lequel un vecteur bi-cistronic contenant des gènes de α- et β-tubulin est exprimé dans les cellules d’insecte^19. Cependant, cette méthode est très lourde et prend beaucoup de temps et est donc principalement utilisée pour étudier l’impact des mutations de la tubuline²⁰ et des isotypes de la tubuline^21,22,23 in vitro.

Dans le protocole actuel, nous décrivons une méthode qui utilise l’approche bien établie et largement utilisée de polymérisation-dépolymérisation comme modèle pour produire la tubuline avec différents niveaux de modification soit des lignes cellulaires ou du tissu cérébral de souris²⁴. Dans cette procédure, la tubuline est pédalée entre la forme soluble (dimère tubuline à 4 °C) et polymère (microtubule à 30 °C en présence de guanosine 5′-triphosphate [GTP]). Chaque forme est séparée par des étapes successives de centrifugation : les dimers de tubuline resteront dans le supernatant après une rotation froide (4 °C), tandis que les microtubules seront granulés à 30 °C. En outre, une étape de polymérisation est effectuée à haute concentration de piperazine-N,N′-bis (acide 2-éthanesulfonique) (PIPES), ce qui permet l’élimination des protéines associées aux microtubules des microtubules et donc, de la tubuline finalement purifiée. La tubuline purifiée à partir des cellules HeLa S3 cultivées sous forme de cultures de suspension ou d’adhérent est pratiquement exempte de n’importe quelle tubuline PTM et a été utilisée dans des expériences récentes de reconstitution in vitro^25,26,27,28. Nous avons en outre adapté la méthode pour purifier la tubuline à partir de cerveaux de souris simples, qui peuvent être utilisés pour un grand nombre de modèles de souris avec des changements dans les isotypes de la tubuline et les MNP.

Dans le protocole, nous décrivons d’abord la génération du matériau source (masse cellulaire ou tissu cérébral), sa lyse (figure 1A), suivie des étapes successives de polymérisation et de dénolysation des tubulines pour purifier la tubuline (Figure 1B). Nous décrivons en outre le processus d’évaluation de la pureté (figure 2A,B) et de la quantité (figure 3A,B) de la tubuline purifiée. La méthode peut être adaptée pour produire de la tubuline enrichie d’un PTM sélectionné en surexprimant une enzyme modérable dans les cellules avant la purification de la tubuline (Figure 4B). Alternativement, des enzymes modifiant la tubuline peuvent être ajoutées à la tubuline pendant le processus de purification. Enfin, nous pouvons purifier la tubuline dépourvue d’isotypes spécifiques ou de MNP provenant du cerveau de souris déficientes dans les enzymes correspondantes modificateurs de la tubuline (figure 4B)²⁹.

La méthode que nous décrivons ici présente deux avantages principaux : (i) elle permet la production de quantités suffisamment importantes de tubuline en relativement peu de temps, et (ii) elle génère une tubuline pure de haute qualité, avec une composition spécifique d’isotype de tubuline ou des MNP. Dans la vidéo associée de ce manuscrit, nous soulignons quelques-unes des étapes critiques impliquées dans cette procédure.