Zuivering van tubuline met gecontroleerde posttranslationele modificaties en isotypes uit beperkte bronnen door polymerisatie-depolymerisatiecycli
Summary
Dit protocol beschrijft tubulinezuivering uit kleine/middelgrote bronnen zoals gekweekte cellen of enkele muizenhersenen, met behulp van polymerisatie- en depolymerisatiecycli. De gezuiverde tubuline is verrijkt in specifieke isotypes of heeft specifieke posttranslationele modificaties en kan worden gebruikt in in vitro reconstitutietesten om microtubulidynamiek en interacties te bestuderen.
Abstract
Een belangrijk aspect van studies van het microtubulicytoskelet is het onderzoek naar microtubuligedrag in in vitro reconstitutie-experimenten. Ze maken de analyse mogelijk van de intrinsieke eigenschappen van microtubuli, zoals dynamiek, en hun interacties met microtubuli-geassocieerde eiwitten (MAPs). De “tubulinecode” is een opkomend concept dat wijst op verschillende tubuline-isotypes en verschillende posttranslationele modificaties (PTM’s) als regulatoren van microtubuli-eigenschappen en -functies. Om de moleculaire mechanismen van de tubulinecode te onderzoeken, is het cruciaal om in vitro reconstitutie-experimenten uit te voeren met gezuiverde tubuline met specifieke isotypes en PTM’s.
Tot op heden was dit technisch uitdagend omdat hersentubulin, dat veel wordt gebruikt in in vitro experimenten, veel PTM’s herbergt en een gedefinieerde isotypesamenstelling heeft. Daarom ontwikkelden we dit protocol om tubuline te zuiveren uit verschillende bronnen en met verschillende isotypesamenstellingen en gecontroleerde PTM’s, met behulp van de klassieke benadering van polymerisatie- en depolymerisatiecycli. In vergelijking met bestaande methoden op basis van affiniteitszuivering levert deze aanpak zuivere, polymerisatie-competente tubuline op, omdat tubuline die bestand is tegen polymerisatie of depolymerisatie tijdens de opeenvolgende zuiveringsstappen wordt weggegooid.
We beschrijven de zuivering van tubuline uit cellijnen, gekweekt in suspensie of als aanhangculturen, en uit enkele muizenhersenen. De methode beschrijft eerst de generatie van celmassa in zowel suspensie- als aanhanginstellingen, de lysisstap, gevolgd door de opeenvolgende stadia van tubulinezuivering door polymerisatie-depolymerisatiecycli. Onze methode levert tubuline op dat kan worden gebruikt in experimenten die de impact van de tubulinecode op de intrinsieke eigenschappen van microtubuli en microtubuliinteracties met bijbehorende eiwitten aanpakken.
Introduction
Microtubuli spelen een cruciale rol in veel cellulaire processen. Ze geven cellen hun vorm, bouwen meiotische en mitotische spindels voor chromosoomsegregatie en dienen als sporen voor intracellulair transport. Om deze diverse functies uit te voeren, organiseren microtubuli zich op verschillende manieren. Een van de intrigerende vragen in het veld is om de moleculaire mechanismen te begrijpen die de structureel en evolutionair geconserveerde microtubuli in staat stellen zich aan te passen aan deze overvloed aan organisaties en functies. Een potentieel mechanisme is de diversificatie van microtubuli , die wordt gedefinieerd door het concept dat bekend staat als de “tubulinecode”1,2,3. De tubulinecode omvat twee hoofdcomponenten: differentiële integratie van α- en β tubuline-genproducten (tubuline-isotypes) in de microtubuli en tubuline-posttranslationele modificaties (PTM’s).
Sinds de jaren 1970 hebben in vitro reconstitutie-experimenten, gecombineerd met evoluerende lichtmicroscopietechnieken, de weg vrijgemaakt voor belangrijke ontdekkingen over de eigenschappen van microtubuli: dynamische instabiliteit4 en loopbanden5, en hun andere mechanismen en functies6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Bijna alle tot nu toe uitgevoerde in vitro experimenten zijn gebaseerd op tubuline gezuiverd uit hersenweefsel met behulp van herhaalde cycli van polymerisatie en depolymerisatie16,17. Hoewel zuivering uit het hersenweefsel het voordeel oplevert van het verkrijgen van hoogwaardige tubuline in grote hoeveelheden (meestal gramhoeveelheden), is een belangrijk nadeel de heterogeniteit, omdat tubuline gezuiverd uit hersenweefsel een mengsel is van verschillende tubuline-isotypes en is verrijkt met veel tubuline-PTMs. Deze heterogeniteit maakt het onmogelijk om de rol van een bepaald tubuline PTM of isotype af te baken in de controle van microtubuli eigenschappen en functies. Het produceren van assemblage-competente tubuline met gecontroleerde tubuline PTMs en homogene isotype samenstelling is dus essentieel om de moleculaire mechanismen van de tubulinecode aan te pakken.
Onlangs is een benadering ontwikkeld om tubuline te zuiveren door affiniteitschromatografie met behulp van het microtubulibindende TOG-domein (tumor-overexpressed gen) van gist Stu2p18. Bij deze methode wordt tubuline in ruwe lysaten van cellen of weefsel door een kolom geleid waar het zich bindt aan het matrix-geïmmobiliseerde TOG-domein, waardoor de hele tubulinepool van een bepaald, zelfs zeer klein monster kan worden geanalyseerd. De afgelopen jaren is ook een langverwachte aanpak beschreven om recombinante tubuline te zuiveren. Het is gebaseerd op het baculovirussysteem, waarbij een bi-cistronic vector met α- en β tubulinegenen wordt uitgedrukt in insectencellen19. Deze methode is echter zeer omslachtig en tijdrovend en wordt daarom meestal gebruikt voor het bestuderen van de impact van tubulinemutaties20 en tubuline-isotypes21,22,23 in vitro.
In het huidige protocol beschrijven we een methode die de gevestigde en veel gebruikte polymerisatie-depolymerisatiebenadering gebruikt als blauwdruk om tubuline te genereren met verschillende niveaus van modificatie, hetzij van cellijnen of van muishersenweefsel24. Bij deze procedure wordt tubuline gefietst tussen de oplosbare (tubuline dimer bij 4 °C) en gepolymeriseerde vorm (microtubuli bij 30 °C in aanwezigheid van guanosine 5′-trifosfaat [GTP]). Elke vorm wordt gescheiden door opeenvolgende stappen van centrifugeren: tubuline dimers blijven in het supernatant na een koude (4 °C) spin, terwijl microtubuli worden geplet bij 30 °C. Bovendien wordt één polymerisatiestap uitgevoerd bij een hogepiperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonzuur) (PIPES) concentratie, die het mogelijk maakt om microtubuli-geassocieerde eiwitten uit de microtubuli en dus uit de uiteindelijk gezuiverde tubuline te verwijderen. Tubuline gezuiverd uit HeLa S3-cellen gekweekt als suspensie – of aanhangculturen is vrijwel vrij van tubuline PTM en is gebruikt in recente in vitro reconstitutie-experimenten25,26,27,28. We hebben de methode om tubuline te zuiveren van enkele muizenhersenen verder aangepast, die kan worden gebruikt voor een groot aantal muismodellen met veranderingen in tubuline-isotypes en PTM’s.
In het protocol beschrijven we eerst de generatie van het bronmateriaal (celmassa of hersenweefsel), de lysis ervan(figuur 1A),gevolgd door de opeenvolgende stappen van tubulinepolymerisatie en depolymerisatie om de tubuline te zuiveren (Figuur 1B). We beschrijven verder het proces om de zuiverheid (figuur 2A, B) en de hoeveelheid ( figuur3A, B) van de gezuiverde tubuline te beoordelen. De methode kan worden aangepast om tubuline te produceren verrijkt met een geselecteerde PTM door een modificerend enzym in cellen te overexpresseren voorafgaand aan tubulinezuivering (figuur 4B). Als alternatief kunnen tubuline-modificerende enzymen tijdens het zuiveringsproces aan tubuline worden toegevoegd. Ten slotte kunnen we tubuline zonder specifieke isotypes of PTM’s zuiveren uit de hersenen van muizen met een tekort aan de overeenkomstige tubuline-modificerende enzymen (figuur 4B)29.
De methode die we hier beschrijven heeft twee belangrijke voordelen: (i) het maakt de productie van voldoende grote hoeveelheden tubuline in relatief korte tijd mogelijk, en (ii) het genereert hoogwaardige, zuivere tubuline, met ofwel specifieke tubuline isotype samenstelling of PTMs. In de bijbehorende video van dit manuscript belichten we enkele van de kritieke stappen die bij deze procedure betrokken zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven methode biedt een platform om snel hoogwaardige, assemblage-competente tubuline in middelgrote hoeveelheden te genereren uit cellijnen en enkele muizenhersenen. Het is gebaseerd op het gouden-standaardprotocol van tubulinezuivering van runderhersenen die vele jaren in het veld worden gebruikt16,17. Een bijzonder voordeel van de aanpak is het gebruik van suspensieculturen van HeLa S3-cellen, die, eenmaal vastgesteld, grote hoeveelheden cellen op…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de ANR-10-IDEX-0001-02, de LabEx Cell’n’Scale ANR-11-LBX-0038 en het Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005. CJ wordt ondersteund door het Institut Curie, het Franse National Research Agency (ANR) kent ANR-12-BSV2-0007 en ANR-17-CE13-0021 toe, het Institut National du Cancer (INCA) subsidie 2014-PL BIO-11-ICR-1, en de Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) subsidie DEQ20170336. MMM wordt ondersteund door de Fondation Vaincre Alzheimer grant FR-16055p, en door de France Alzheimer grant AAP SM 2019 n°2023. JAS werd ondersteund door het horizon 2020-onderzoek- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. SB werd ondersteund door de FRM-subsidie FDT201805005465.
We danken alle leden van het Janke lab, in het bijzonder J. Souphron, evenals G. Lakisic (Institut MICALIS, AgroParisTech) en A. Gautreau (Ecole Polytechnique) voor hulp bij het opstellen van het protocol. We willen de dierenfaciliteit van het Institut Curie bedanken voor hulp bij het fokken en verzorgen van muizen.
Het antilichaam 12G10, ontwikkeld door J. Frankel en M. Nelson, werd verkregen uit de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa.
Materials
| 1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
| 1-L cell culture vessels | Techne F7610 | Used for spinner cultures. Never stir the empty spinner bottles. When spinner bottles are in the cell culture incubator, always keep the lateral valves of spinner bottles slightly open to facilitate the equilibration of media with incubator’s atmosphere. After use, fill the spinner bottles immediately with tap water to avoid drying of remaining cells on the bottle walls. Wash the bottles with deionised water, add app 200 ml of deionised water and autoclave. Under a sterile cell culture hood remove the water and allow the bottles to dry completely, still under the hood, for several hours. Never use detergents for cleaning the spinner bottles because any trace amounts of the detergent can be deleterious to the cells. | |
| 1.5- and 2-ml tubes | |||
| 14-ml round-bottom tubes | |||
| 15-cm-diameter sterile culture dishes | |||
| 15-ml screw-cap tubes | |||
| 2-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 2-mercaptoethanol is toxic and should be used under the hood. |
| 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride | Sigma | #A8456 | |
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | #161-0140 | |
| 5-, 10- 20-ml syringes | |||
| 5-ml, 10-ml, 25-ml sterile pipettes | |||
| 50-ml screw-cap tubes | |||
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma | #A3678 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody, 12G10 | Developed by J. Frankel and M. Nelson, obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank, developed under the auspices of the NICHD, and maintained by the University of Iowa | dilution: 1/500 | |
| Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335 | AdipoGen | #AG-20B-0020 | dilution: 1/20,000 |
| Aprotinin | Sigma | #A1153 | |
| Balance (0.1 – 10 g) | |||
| Beckman 1-l polypropylene bottles | For collecting spinner cultures | ||
| Beckman Avanti J-26 XP centrifuge | For collecting spinner cultures | ||
| Biological stirrer | Techne MCS-104L | Installed in the cell culture incubator (for spinner cultures), 25 rpm for Hela S3 and HEK 293 cells | |
| Bis N,N’-Methylene-Bis-Acrylamide | Bio-Rad | #161-0201 | |
| Blender IKA Ultra-Turrax® | For lysing brain tissue, use 5-mm probe, with the machine set at power 6 or 7. Blend the brain tissue 2-3 times for 15 s on ice. | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | #A7906 | |
| Bromophenol blue | Sigma | #1.08122 | |
| Carboxypeptidase A (CPA) | Sigma | #C9268 | Concentration: 1.7 U/µl |
| Cell culture hood | |||
| Cell culture incubator set at 37°C, 5% CO2 | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO can enhance cell and skin permeability of other compounds. Avoid contact and use skin and eye protection. |
| DMEM medium | Life Technologies | #41965062 | |
| DTT, DL-Dithiothreitol | Sigma | #D9779 | |
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | #E3889 | |
| Ethanol absolute | Fisher Chemical | #E/0650DF/15 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F7524 | |
| French pressure cell press | Thermo electron corporation | #FA-078A | with a #FA-032 cell; for lysing big amounts of cells. Set at medium ratio, and the gauge pressure of 1,000 psi (corresponds to 3,000 psi inside the disruption chamber). |
| Glycerol | VWR Chemicals | #24388.295 | |
| Glycine | Sigma | #G8898 | |
| GTP | Sigma | #G8877 | |
| Heating block | Stuart | #SBH130D | |
| Hela cells | ATCC® CCL-2™ | ||
| Hela S3 cells | ATCC | ATCC® CCL-2.2™ | |
| Hydrochloric acid (HCl ) | VWR | #20252.290 | |
| Inverted microscope | With fluorescence if cell transfection is to be verified | ||
| Isopropanol | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus | #101 | |
| JLA-8.1000 rotor | For collecting spinner cultures | ||
| KOH | Sigma | #P1767 | KOH is corrosive and causes burns; use eye and skin protection. |
| L-Glutamine | Life Technologies | #25030123 | |
| Laboratory centrifuge for 50-ml tubes | Sigma | 4-16 K | |
| Leupeptin | Sigma | #L2884 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Micro-pipettes p2.5, p10, p20, p100, p200 and p1000 and corresponding tips | |||
| Micropestles | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| Mouse brain tissue | Animal care and use for this study were performed in accordance with the recommendations of the European Community (2010/63/UE). Experimental procedures were specifically approved by the ethics committee of the Institut Curie CEEA-IC #118 (authorization no. 04395.03 given by National Authority) in compliance with the international guidelines. | ||
| Needles 18G X 1 ½” (1.2 X 38 mm | Terumo | #18G | |
| Needles 20G X 1 ½” (0.9 X 38 mm | Terumo | #20G | |
| Needles 21G X 4 ¾” (0.8 X 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
| Parafilm | |||
| PBS | Life Technologies | #14190169 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140130 | |
| pH-meter | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | #P7626 | PMSF powder is hazardous. Use skin and eye protection when preparing PMSF solutions. |
| PIPES | Sigma | #P6757 | |
| Pipette-boy | |||
| Rotors | Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; and TLA 55 | ||
| SDS-PAGE electrophoresis equipment | Bio-Rad | #1658001FC | |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | VWR | #442444H | For preparing Laemmeli buffer |
| SDS, Sodium dodecyl sulphate | Sigma | #L5750 | For preparing 'TUB' SDS-PAGE gels |
| Sonicator | Branson | #101-148-070 | Used for lysing cells grown as adherent cultures. Use 6.5 mm diameter probe, set the sonicator at “Output control” 1, “Duty cycle” 10% and time depending on the cell type used. |
| Tabletop centrifuge for 1.5 ml tubes | Eppendorf | 5417R | |
| TEMED, N, N, N′, N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma | #9281 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
| Triton X-100 | Sigma | #T9284 | |
| Trizma base (Tris) | Sigma | #T1503 | |
| Trypsin | Life Technologies | #15090046 | |
| Ultracentrifuge rotors | TLA-55, TLA-100.3 and 70.1 Ti rotors | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #357448 | for using with TLA-55 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #349622 | for using with TLA-100.3 rotor |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | #355631 | for using with 70.1 Ti rotor |
| Ultracentrifuges | Beckman | Optima L80-XP (or equivalent) and Optima MAX-XP (or equivalent) | Set at 4°C or 30°C based on the need of the experiment |
| Vortex mixer | |||
| Water bath equipped with floaters or tube holders | Set at 30°C |
References
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Margolis, R. L., Wilson, L. Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell. 13 (1), 1-8 (1978).
- Borisy, G. G., Olmsted, J. B. Nucleated assembly of microtubules in porcine brain extracts. Science. 177 (55), 1196-1197 (1972).
- Kirschner, M. W., Williams, R. C. The mechanism of microtubule assembly in vitro. Journal of Supramolecular Structure. 2 (2-4), 412-428 (1974).
- Baas, P. W., Lin, S. Hooks and comets: The story of microtubule polarity orientation in the neuron. Developmental Neurobiology. 71 (6), 403-418 (2011).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
- Schaedel, L., et al. Microtubules self-repair in response to mechanical stress. Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).
- Hendricks, A. G., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Reconstituting the motility of isolated intracellular cargoes. Methods in Enzymology. 540, 249-262 (2014).
- Dogterom, M., Surrey, T. Microtubule organization in vitro. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 23-29 (2013).
- Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Widlund, P. O., et al. One-step purification of assembly-competent tubulin from diverse eukaryotic sources. Molecular Biology of the Cell. 23 (22), 4393-4401 (2012).
- Minoura, I., et al. Overexpression, purification, and functional analysis of recombinant human tubulin dimer. FEBS Letters. 587 (21), 3450-3455 (2013).
- Uchimura, S., et al. A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation. Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).
- Pamula, M. C., Ti, S. C., Kapoor, T. M. The structured core of human beta tubulin confers isotype-specific polymerization properties. Journal of Cell Biology. 213 (4), 425-433 (2016).
- Vemu, A., et al. Structure and dynamics of single-isoform recombinant neuronal Human tubulin. Journal of Biological Chemistry. 291 (25), 12907-12915 (2016).
- Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability. Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).
- Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14, 1634-1660 (2019).
- Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
- Nirschl, J. J., Magiera, M. M., Lazarus, J. E., Janke, C., Holzbaur, E. L. F. alpha-Tubulin tyrosination and CLIP-170 phosphorylation regulate the initiation of dynein-driven transport in neurons. Cell Reports. 14 (11), 2637-2652 (2016).
- Guedes-Dias, P., et al. Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse. Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).
- Luo, Y., et al. Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy. Nature Communications. 11 (1), 18 (2020).
- Even, A., et al. ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport. Science Advances. 5 (12), 2705 (2019).
- Wolff, J., Sackett, D. L., Knipling, L. Cation selective promotion of tubulin polymerization by alkali metal chlorides. Protein Science. 5 (10), 2020-2028 (1996).
- Magiera, M. M., et al. Excessive tubulin polyglutamylation causes neurodegeneration and perturbs neuronal transport. EMBO Journal. 37 (23), 100440 (2018).
- Lacroix, B., Janke, C. Generation of differentially polyglutamylated microtubules. Methods in Molecular Biology. 777, 57-69 (2011).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Magiera, M. M., Janke, C., Correia, J. J., Wilson, L. . Methods in Cell Biology Vol. 115 Microtubules, in vitro. , 247-267 (2013).
- Hausrat, T. J., Radwitz, J., Lombino, F. L., Breiden, P., Kneussel, M. Alpha- and beta-tubulin isotypes are differentially expressed during brain development. Developmental Neurobiology. , (2020).
- Janke, C., et al. Tubulin polyglutamylase enzymes are members of the TTL domain protein family. Science. 308 (5729), 1758-1762 (2005).
- Newton, C. N., et al. Intrinsically slow dynamic instability of HeLa cell microtubules in vitro. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42456-42462 (2002).
- Belvindrah, R., et al. Mutation of the alpha-tubulin Tuba1a leads to straighter microtubules and perturbs neuronal migration. Journal of Cell Biology. 216 (8), 2443-2461 (2017).
- Breuss, M., et al. Mutations in the murine homologue of TUBB5 cause microcephaly by perturbing cell cycle progression and inducing p53 associated apoptosis. Development. , (2016).
- Latremoliere, A., et al. Neuronal-specific TUBB3 is not required for normal neuronal function but is essential for timely axon regeneration. Cell Reports. 24 (7), 1865-1879 (2018).
- Morley, S. J., et al. Acetylated tubulin is essential for touch sensation in mice. Elife. 5, (2016).
