פיתוח ובדיקה של מבחני PCR כמותיים ספציפיים למינים עבור יישומי DNA סביבתיים
Summary
בדיקות DNA סביבתיות דורשות תכנון קפדני, בדיקות, אופטימיזציה ואימות לפני תחילת איסוף נתוני השדה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שייקח את המשתמשים דרך כל שלב של תכנון בדיקת qPCR ספציפית למינים, מבוססת בדיקה לגילוי וכימות של דנ”א של מיני יעד מדגימות סביבתיות.
Abstract
שיטות חדשות ולא פולשניות לגילוי וניטור נוכחות מינים מפותחות כדי לסייע בניהול הדיג ושימור חיות הבר. השימוש בדגימות DNA סביבתיות (eDNA) לגילוי מקרוביוטה הוא קבוצה כזו של שיטות שהופכות במהירות לפופולריות ומיושמות בתוכניות ניהול לאומיות. כאן אנו מתמקדים בפיתוח מבחנים ממוקדים ספציפיים למינים עבור יישומי PCR כמותי (qPCR) מבוססי בדיקה. שימוש qPCR מבוסס בדיקה מציע ספציפיות רבה יותר מאשר אפשרי עם פריימרים בלבד. יתר על כן, היכולת לכמת את כמות ה- DNA במדגם יכולה להיות שימושית בהבנתנו את האקולוגיה של eDNA ואת הפרשנות של דפוסי זיהוי eDNA בתחום. יש צורך בשיקול דעת זהיר בפיתוח ובדיקה של מבחנים אלה כדי להבטיח את הרגישות והספציפיות של גילוי מיני היעד מדגם סביבתי. בפרוטוקול זה נתוו את השלבים הדרושים לתכנון ובדיקה של מבחנים מבוססי בדיקה לגילוי מין יעד; כולל יצירת מסדי נתונים של רצף, עיצוב מבחנים, בחירה ואופטימיזציה, בדיקת ביצועים של מבחני ביצועים ואימות שדות. ביצוע שלבים אלה יסייע בהשגת חקירה יעילה, רגישה וספציפית שניתן להשתמש בה בביטחון. אנו מדגימים תהליך זה עם ההסתערות שלנו המיועדת לאוכלוסיות של הרפש(Actinonaias רצועה),מינים מולים מים מתוקים נמצאו בנהר Clinch, ארה”ב.
Introduction
חוקרים ומנהלים מתעניינים יותר ויותר בשימוש ב-DNA סביבתי לגילוי מינים. במשך שלושה עשורים, PCR כמותי או בזמן אמת (qPCR / rtPCR) שימש בתחומים רבים לגילוי וכימות ספציפיים לרצף של חומצות גרעין1,2. בתוך התחום החדש יחסית של מחקר eDNA, השימוש ב מבחנים אלה עם עקומה סטנדרטית לכימות עותקים של DNA היעד לכל נפח או משקל של דגימת eDNA הפך עכשיו בפועל שגרתי. רצפי דנ”א מיטוכונדריאליים ממוקדים בדרך כלל ב-eDNA assays מכיוון שהגנום המיטוכונדריאלי קיים באלפי עותקים לתא, אך גם בדיקות לדנ”א גרעיני או לרצפי RNA אפשריות. חשוב להבין כי מבחנים שפורסמו עבור דגימות eDNA אינם תמיד שווים בביצועים. האמינות של בדיקה לגילוי דנ”א של מין יעד בלבד (כלומר, ספציפיות) וזיהוי כמויות נמוכות של דנ”א מטרה (כלומר, רגישות) עשויות להשתנות במידה ניכרת בשל הבדלים באופן שבו הבדיקה תוכננה, נבחרה, אופטימלה ונבדקה. בעבר התעלמו במידה רבה מהמדדים הכמותיים המדווחים לביצועי מבחנים, אך לאחרונה התעלמו מהסטנדרטים לשיפורהשקיפותבפיתוח מבחנים 3,4,5,6,7,8.
אופטימיזציה ודיווח של עזרי ביצועים מבחני מחקר בעיצוב מחקר ופרשנות של תוצאות סקר eDNA. מבחנים המצליבים עם דנ”א של מינים שאינם מיועדים למטרה עלולים להוביל לגילויים חיוביים כוזבים, בעוד שמבחנים בעלי רגישות לקויה עלולים להיכשל בזיהוי הדנ”א של מיני היעד גם כאשר הוא נמצא במדגם (תשלילים כוזבים). הבנה של רגישות ובחירה במהלך הבחינת תסייע ליידע את מאמץ הדגימה הדרוש לגילוי מינים נדירים. בגלל שיש מקורות טבעיים רבים של וריאציה eDNA, מחקרים חייבים להגביל מקורות לשליטה של וריאציה ככל האפשר, כולל אופטימיזציה מלאה ואפיון eDNA assay3.
תנאים המשפיעים ישירות על הספציפיות או הרגישות של ההסתעפות ישנו את ביצועי ההסתעפות. זה יכול להתרחש בתנאי מעבדה שונים (כלומר, ריאגנטים שונים, משתמשים, מכונות וכו ‘). לכן, יש לבחון מחדש פרוטוקול זה בעת החלת בדיקה בתנאים חדשים. אפילו מבחנים המאופיינים היטב בספרות צריך להיבדק אופטימיזציה כאשר אומץ על ידי מעבדה חדשה או בעת שימוש ריאגנטים שונים (למשל, פתרון מאסטר לערבב)5,9. הספציפיות של בדיקה עשויה להשתנות כאשר היא חלה על אזור גיאוגרפי אחר, מכיוון שהבדיקה מוחלת על דגימות מקהילה ביוטית חדשה שעשויה לכלול מינים שאינם יעדים שהבדיקה לא נבדקה נגדם, וייתכן שתתרחש שונות גנטית במין היעד. שוב, יש להעריך מחדש את ההסתעפות בעת שימוש במיקום חדש. תנאי השדה שונים מתנאי מעבדה כי בתחום מעכבי PCR נוטים יותר להיות נוכחים בדגימות. מעכבי PCR משפיעים ישירות על תגובת ההגברה ובכך משפיעים על ביצועי ההגברה. מסיבה זו, נדרשת שליטה חיובית פנימית בעת פיתוח בדיקת eDNA.
לבסוף, התנאים הסביבתיים בשטח יכולים להשפיע על מולקולות הדנ”א של מיני המטרה ועל לכידתן באמצעות השפלת דנ”א, הובלה ושימור. יתר על כן, פרוטוקולים שונים לאיסוף וחילוץ DNA משתנים ביעילותם וביכולתם לשמור על DNA. עם זאת, חשוב לציין כי תהליכים אלה משפיעים על יכולת הגילוי של eDNA אך לא על הביצועים של מבחנים מולקולריים. לכן, יכולת הגילוי של DNA ממין היעד בדגימות שדה היא פונקציה של הביצועים הטכניים של בדיקת qPCR, כמו גם תנאי שדה ופרוטוקולי איסוף, אחסון וחילוץ. בעת שימוש בהסתעפות מאופיינת היטב וביצועים גבוהים, משתמשים יכולים להרגיש בטוחים ביכולות של ההסתעפות; מתן אפשרות לחוקרים להתמקד כעת בהבנת גורמי ההסתעפות החיצוניים (כלומר, משתנים סביבתיים, הבדלים בפרוטוקולי לכידה או חילוץ) המשפיעים על זיהוי eDNA.
כאן אנו מתמקדים במיוחד בביצועים הטכניים של Assay באמצעות תכנון ואופטימיזציה קפדניים. אנו מדגימים את הפרוטוקול באמצעות בדיקה מבוססת בדיקה שפותחה לגילוי מולים של מים מתוקים, הראקט(רצועה Actinonaias),ממים שנדגמו בנהר קלינץ ‘, ארה”ב. לאחרונה Thalinger et al. (2020) הציג הנחיות לאימות מבחני eDNA ממוקדים. תכנון מבחנים בהתאם לפרוטוקול שלנו יביא מבחנים לרמה 4 של תלינגר ואח ‘בתוספת צעד נוסף לקראת רמה 56. בשלב זה הביצועים הטכניים של בדיקה יהיו ממוטבים והיא תהיה מוכנה לשימוש קבוע ביישומי מעבדה ושדה. שימוש נוסף ב- assay במעבדה, mesocosm, וניסויי שדה לאחר מכן יכול לענות על שאלות לגבי זיהוי eDNA וגורמים המשפיעים על יכולת הגילוי, השלבים הסופיים עבור אימות רמה 56.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמו בכל מחקר, הגדרת השאלה שיש לטפל בה היא הצעד הראשון ועיצוב מבחני eDNA תלוי בהיקף המחקר26. לדוגמה, אם מטרת המחקר או הסקר היא לזהות מין אחד או כמה, בדיקה ממוקדת מבוססת בדיקה היא הטובה ביותר. אם, לעומת זאת, המטרה היא להעריך חבילה גדולה יותר או מכלול של מינים, מבחני metabarcoding רצף תפוקה גבוהה מתאימים יותר. לאחר שייקבע איזו גישה לנקוט, מומלץ לבצע מחקר פיילוט הכולל תכנון מבחנים, בדיקות ואופטימיזציה.24. עיצוב Assay מתחיל עם רשימה של מינים כמתואר ב איור 1. רשימה זו תיחשב כבסיס להבנת הביצועים הטובים של בדיקה במונחים של ספציפיות והטווח הגיאוגרפי עליו היא עשויה לחול6,10. מומלץ לעצב את הבדיקה עבור אזור גיאוגרפי מסוים, המאפשרת למעצב לבחון טוב יותר בדיקה לתגובה צולבת נגד מינים אחרים באזור זה, ולהיות מודע למגבלות שיש לכך על הרחבת בדיקה לאזורים אחרים שבהם מין יעד עלול להתרחש24. לאחר השלמת הרשימה, ניתן להוריד רצפים ממאגרי מידע גנטיים ציבוריים. מאחר שמסדי נתונים אלה אינם שלמים27יש לרצף כמה שיותר מינים ברשימה כדי להשלים את מסד הנתונים המקומי של רצפים שישמשו בעיצוב מבחנים. לתעדף מינים הקשורים זה לזה, שכן אלה הם המטרות הלא-מטרות הסבירות ביותר שיגברו. התמקדות בכל המינים בתוך אותו סוג או משפחה כמו מיני היעד היא מקום טוב להתחיל בו. השוואות עם מינים קרובים יסייעו בזיהוי אזורי רצף ייחודיים למין היעד. פעולה זו יכולה לסייע בהיידע כיצד ההסכמה עשויה לתפקד במערכות או במיקומים אחרים. אזורים מיטוכונדריים הם הבחירה הרגילה להתפתחות מבחנים, מכיוון שיותר מידע רצף ממגוון רחב יותר של מינים זמין בגנים מיטוכונדריים ששימשו בפרויקטים של ברקוד של החיים, ומכיוון שדנ”א מיטוכונדריאלי קיים בריכוז גדול בהרבה בעותקים/תאים מאשר DNA גרעיני24,28,29. אזורי גנים מרובים יש להעריך להתפתחות בדיקה נוספת כמו כיסוי רצף משתנה בין taxa במסדי הנתונים מאגר גנטי. לאחר יצירת מסד נתונים מקומי זה של רצפי הפניה, שילוב של הדמיה ידנית של נתוני רצף מיושרים ותוכנות מחשב משמש לעיצוב מבחני פריימר/בדיקה. אין להסתמך אך ורק על תוכנה כדי לקבוע אילו מבחנים לבדוק. חשוב לאמת באופן חזותי על יישורים שבו פריימרים ובדיקות לשבת על המטרות ולא מטרות כדי לקבל הבנה טובה יותר של איך הם עשויים לפעול PCR. לבסוף בדיקה סינון ואופטימיזציה כולל שלוש רמות (ב silico, במבחנה וב situ)6,7,24,25. ב silico עיצוב ובדיקות חשובים להפקת רשימה קצרה של מבחנים עם סיכוי טוב להצלחה, אבל אמפירי (במבחנה) בדיקות הוא חיוני לבחירת הבדיקה עם הביצועים הטובים ביותר בפועל. אין ויטרו אופטימיזציה ובדיקה של מבחנים כוללים מדידת יעילות התגובה והגדרת הרגישות והספציפיות של הבדיקה. גבולות הזיהוי והכימות הם שני פרמטרים שלעתים קרובות מתעלמים מהם בפיתוח מבחנים אך חשובים לפרשנות נתונים. על ידי הפעלת עותקים משוכפלים מרובים של עקומות סטנדרטיות עבור מבחנים, LOD ו LOQ ניתן למדוד בקלות1,5,30. מחקרים מעטים דנים בתוצאות ביחס ללוד או LOQ של הבדיקה, אך סנגופטה ואח ‘ (2019) משלבים את LOD ו- LOQ של הבדיקה שלהם בפרשנות הנתונים והגרפיקה שלהם להבנה ברורה יותר של התוצאות שלהם31. פקדים חיוביים פנימיים צריכים להיות מולטיפלקס לתוך ההסתערות המתוכננת גם כן. ללא בדיקה של עיכוב PCR בדגימות, תשלילים כוזבים עלולים להתרחש24,32. אנו מציעים את השימוש בבדיקת IPC מרובתxed עם הבדיקה היעד כשיטה הקלה ביותר עבור בדיקות עיכוב PCR23. לבסוף, בבדיקות situ של הבדיקה משדה ומעבדה שנאספו דגימות יש צורך להבטיח הגברה היעד מתרחשת בדגימות סביבתיות24.
קיימות מגבלות לשימוש במינים ספציפיים למינים, בדיקות qPCR מבוססות בדיקה עם דגימות eDNA. לדוגמה, תכנון מבחנים מרובים לבדיקה עשוי להיות מוגבל על ידי זמינות רצף, וייתכן שיהיה צורך להתפשר על היבטים של ביצועים הבדיקה. בחירות אלה חייבות להיות מונחות על ידי מטרות המחקר ויש לדווח עליהן עם התוצאות26. לדוגמה, אם המטרה היא זיהוי של מין נדיר וצפויות מעט תוצאות חיוביות, ניתן יהיה להשתמש במבחן עם ספציפיות לא מושלמת (כלומר הגברה של מינים שאינם מיועדים למטרה) אם כל הגילויים יאומתו על ידי רצף. אם המטרה היא ניטור הטווח הגיאוגרפי של מין ונתוני ריכוז eDNA אין צורך, ניתן להשתמש ב-assay עם יעילות לא מושלמת ונתונים שדווחו רק כאחוזי זיהוי. יתר על כן, אלא אם כן כל conspecifics הפוטנציאלי נבדקים במעבדה, אשר לעתים רחוקות אפשרי, אי אפשר לדעת בוודאות מוחלטת את הספציפיות האמיתית של בדיקה. לדוגמה, הבדיקה תוכננה ונבדקה מול מספר מיני מולים של מים מתוקים בנהר קלינץ’. כדי להשתמש בבדיקה זו במערכת נהר אחרת, נצטרך לבדוק אותה מול חבילה של מינים במיקום החדש. וריאציה גנטית בתוך המין או האוכלוסייה שאינה נבדקת במהלך התפתחות בדיקה עשויה להשפיע גם על הספציפיות. לבסוף, גם אם בדיקה אומתה כבעלת ביצועים טכניים גבוהים; התנאים משתנים בעת עבודה בשדה. תנאים שאינם קשורים לפיקוח כגון זרימת מים, pH והתנהגות בעלי חיים יכולים לשנות את יכולת הגילוי של eDNA כפי שניתן להשתמש בפרוטוקולי איסוף ומיצוי שונים של eDNA. שימוש בהסתעפויות ממוטבות ומתוארות היטב יסייע להקל על הבנת ההשפעה שיש לפרמטרים כאלה על זיהוי eDNA.
תחום eDNA מתבגר מעבר לשלב של ניתוח גישוש להגברת הסטנדרטיזציה של שיטות וטכניקות. התפתחויות אלה ישפרו את הבנתנו את הטכניקות, היכולות והמגבלות של eDNA. תהליך האופטימיזציה שאנו מתארים לעיל משפר את הרגישות, הספציפיות והשחזור של ההסמכה. המטרה הסופית של עידון זה ותקינה של שיטות eDNA היא לשפר את היכולות של החוקרים כדי להפוך מסקנות המבוססות על נתוני eDNA, כמו גם להגדיל את אמון משתמש הקצה ובעל היתד בתוצאות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לאלווי ווד וטרודי פרוסט שעזרו בפיתוח ובדיקות ראשוניות. המימון לתכנון מבחנים שדווח במחקר זה סופק על ידי התוכנית למחקר ופיתוח סביבתי אסטרטגי של משרד ההגנה (RC19-1156). כל שימוש בשמות מסחריים, מוצרים או חברות הוא למטרות תיאוריות בלבד ואינו מרמז על תמיכה של ממשלת ארה”ב. נתונים שנוצרו במהלך מחקר זה זמינים כמו מהדורת נתונים USGS https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5.
Materials
| 96 Place Reversible Racks with Covers | Globe Scientific | 456355AST | |
| Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.) | Kimberly-Clark | 43431, 55090 | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855196 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 5408129 | |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL | Fisher Scientific | 2681332 | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | Bio-Rad | #HSP9601 | |
| IPC forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates | Labnet | C1000 | |
| Microcentrifuge machine | Various | – | Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay. |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | Bio-Rad | MSB1001 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Invitrogen | AM9932 | |
| Pipette Tips GP LTS 1000 µL F 768A/8 | Rainin | 30389272 | |
| Pipette Tips GP LTS 20 µL F 960A/10 | Rainin | 30389274 | |
| Pipette Tips GP LTS 200 µL F 960A/10 | Rainin | 30389276 | |
| Pipettes | Rainin | Various | Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes. |
| TaqMan Environmental Master Mix 2.0 | Thermo Fisher Scientific | 4396838 | |
| Target forward and reverse primers | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target PrimeTime qPCR Probes | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product |
| Target synthetic gBlock gene fragment | Integrated DNA Technologies, Inc. | none | custom product. used for qPCR standard dilution series |
| TE Buffer | Invitrogen | AM9849 | |
| VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER | Fisher Scientific | 50728002 |
References
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 95-125 (2006).
- Higuchi, R. D., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology. 10, 5 (1992).
- Mauvisseau, Q., et al. Influence of accuracy, repeatability and detection probability in the reliability of species-specific eDNA based approaches. Scientific Reports. 9 (1), 580 (2019).
- Hernandez, C., et al. 60 specific eDNA qPCR assays to detect invasive, threatened, and exploited freshwater vertebrates and invertebrates in Eastern Canada. Environmental DNA. , (2020).
- Klymus, K. E., et al. Reporting the limits of detection and quantification for environmental DNA assays. Environmental DNA. , (2019).
- Thalinger, B., et al. A validation scale to determine the readiness of environmental DNA assays for routine species monitoring. bioRxiv. , (2020).
- Helbing, C. C., Hobbs, J. Environmental DNA Standardization Needs for Fish and Wildlife Population Assessments and Monitoring. CSA Group. , (2019).
- Sepulveda, A. J., Nelson, N. M., Jerde, C. L., Luikart, G. Are Environmental DNA Methods Ready for Aquatic Invasive Species Management. Trends in Ecology & Evolution. , (2020).
- Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS One. 8 (3), 59520 (2013).
- Prediger, E. How to design primers and probes for PCR and qPCR. IDT. , (2020).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39, 145-154 (2011).
- Owczarzy, R., et al. IDT SciTools: a suite for analysis and design of nucleic acid oligomers. Nucleic Acids Research. 36, 163-169 (2008).
- Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research. 35, 43-46 (2007).
- Taylor, S. C., et al. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends in Biotechnology. 37 (7), 761-774 (2019).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (134), 11 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic Local Alignment Search Tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Bio-Rad. . Bio-Rad Vol. 5279. , (2020).
- Bio-Rad. . Bio-Rad Vol. 6894. , (2020).
- Eurogentec. . Eurogentec. Vol. 0708-V2. , (2020).
- Bustin, S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).
- Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
- Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).
- Guan, X., et al. Environmental DNA (eDNA) Assays for Invasive Populations of Black Carp in North America. Transactions of the American Fisheries Society. 148 (6), 1043-1055 (2019).
- Mosher, B. A., et al. Successful molecular detection studies require clear communication among diverse research partners. Frontiers in Ecology and the Environment. 18 (1), 43-51 (2019).
- Kwonga, S., Srivathsana, A., Meier, R. An update on DNA barcoding: low species coverage and numerous unidentified sequences. Cladistics. 28, 6 (2012).
- Rees, H. C., et al. REVIEW: The detection of aquatic animal species using environmental DNA – a review of eDNA as a survey tool in ecology. Journal of Applied Ecology. 51 (5), 1450-1459 (2014).
- Evans, N. T., Lamberti, G. A. Freshwater fisheries assessment using environmental DNA: A primer on the method, its potential, and shortcomings as a conservation tool. Fisheries Research. 197, 60-66 (2018).
- Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
- Sengupta, M. E., et al. Environmental DNA for improved detection and environmental surveillance of schistosomiasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (18), 8931-8940 (2019).
- Klymus, K. E., Richter, C. A., Chapman, D. C., Paukert, C. Quantification of eDNA shedding rates from invasive bighead carp Hypophthalmichthys nobilis and silver carp Hypophthalmichthys molitrix. Biological Conservation. 183, 77-84 (2015).
