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Environment

Entwicklung und Prüfung artspezifischer quantitativer PCR-Assays für Umwelt-DNA-Anwendungen

Published: November 05, 2020
doi:
10.3791/61825
, , ,
1Columbia Environmental Research Center,U.S. Geological Survey

Summary

Umwelt-DNA-Assays erfordern eine strenge Konzeption, Prüfung, Optimierung und Validierung, bevor mit der Erfassung von Felddaten begonnen werden kann. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Benutzer durch jeden Schritt der Entwicklung eines artspezifischen, sonsonenbasierten qPCR-Tests zum Nachweis und zur Quantifizierung einer Zielart-DNA aus Umweltproben zu führen.

Abstract

Neue, nichtinvasive Methoden zur Erkennung und Überwachung des Vorhandenseins von Arten werden entwickelt, um die Fischerei und das Schutzmanagement von Wildtieren zu unterstützen. Die Verwendung von Umwelt-DNA -Proben (eDNA) zum Nachweis von Makrobiota ist eine solche Gruppe von Methoden, die schnell populär wird und in nationalen Management-Programmen implementiert wird. Hier konzentrieren wir uns auf die Entwicklung artspezifischer zielgerichteter Assays für sonsonsbasierte quantitative PCR-Anwendungen (qPCR). Die Verwendung von sondenbasierter qPCR bietet eine größere Spezifität, als dies allein bei Primern möglich ist. Darüber hinaus kann die Fähigkeit, die Menge der DNA in einer Probe zu quantifizieren, für unser Verständnis der Ökologie von eDNA und die Interpretation von eDNA-Detektionsmustern auf dem Gebiet nützlich sein. Bei der Entwicklung und Erprobung dieser Assays ist sorgfältige Berücksichtigung erforderlich, um die Empfindlichkeit und Spezifität des Nachweises der Zielarten aus einer Umweltprobe zu gewährleisten. In diesem Protokoll werden wir die Schritte abstecken, die erforderlich sind, um sondenbasierte Assays für den Nachweis einer Zielart zu entwerfen und zu testen; einschließlich Erstellung von Sequenzdatenbanken, Assay-Design, Assay-Auswahl und -Optimierung, Test-Assay-Performance und Feldvalidierung. Wenn Sie diese Schritte ausführen, erhalten Sie einen effizienten, sensiblen und spezifischen Test, der mit Vertrauen verwendet werden kann. Wir demonstrieren diesen Prozess mit unserem Test für Populationen der Mucket (Actinonaias ligamentina), einer Süßwassermuschelart, die im Clinch River, USA, vorliegt.

Introduction

Forscher und Manager interessieren sich zunehmend für die Verwendung von Umwelt-DNA-Assays für den Artennachweis. Seit drei Jahrzehnten wird quantitative oder Echtzeit-PCR (qPCR/rtPCR) in zahlreichen Bereichen zur sequenzspezifischen Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren1,2eingesetzt. Innerhalb des relativ neuen Feldes der eDNA-Forschung ist die Verwendung dieser Assays mit einer Standardkurve zur Quantifizierung von Kopien der Ziel-DNA pro Volumen oder Gewicht der eDNA-Probe mittlerweile zur Routine geworden. Mitochondriale DNA-Sequenzen werden in der Regel in eDNA-Assays gezielt, da das mitochondriale Genom in Tausenden von Kopien pro Zelle vorhanden ist, aber auch Assays für kernnukleare DNA oder RNA-Sequenzen möglich sind. Es ist wichtig zu verstehen, dass veröffentlichte Assays für eDNA-Proben nicht immer leistungsgleich sind. Die Zuverlässigkeit eines Tests beim Nachweis nur der DNA einer Zielart (d. h. Spezifität) und dem Nachweis geringer Mengen an Ziel-DNA (d. h. Empfindlichkeit) kann aufgrund von Unterschieden in der Art und Weise, wie der Assay entworfen, ausgewählt, optimiert und getestet wurde, erheblich variieren. Die Berichterstattung über quantitative Kennzahlen der Assay-Performance wurde bisher weitgehend übersehen, aber in jüngster Zeit entstehen Standards zur Verbesserung der Transparenz in der Assay-Entwicklung3,4,5,6,7,8.

Optimierung und Berichterstattung von Assay-Leistungshilfen bei der Studiengestaltung und Interpretation von eDNA-Umfrageergebnissen. Assays, die mit der DNA von Nicht-Zielarten kreuzreagieren, können zu falsch positiven Detektionen führen, während Assays mit schlechter Empfindlichkeit die DNA der Zielart nicht erkennen können, selbst wenn sie in der Probe vorhanden ist (falsche Negative). Ein Verständnis der Assay-Empfindlichkeit und Selektivität wird dazu beitragen, die Probenahmebemühungen zu informieren, die erforderlich sind, um seltene Arten zu erkennen. Da es viele natürliche Variationsquellen in eDNA gibt, müssen Studien kontrollierbare Variationsquellen so weit wie möglich begrenzen, einschließlich der vollständig enoptierenden und charakterisierenden eDNA-Assay3.

Bedingungen, die sich direkt auf die Spezifität oder Empfindlichkeit eines Assays auswirken, ändern die Leistung des Assays. Dies kann unter verschiedenen Laborbedingungen (z. B. verschiedenen Reagenzien, Anwendern, Maschinen usw.) auftreten. Daher sollte dieses Protokoll bei der Anwendung eines Assays unter neuen Bedingungen erneut überprüft werden. Auch in der Literatur gut charakterisierte Assays sollten getestet und optimiert werden, wenn sie von einem neuen Labor oder bei Verwendung verschiedener Reagenzien (z.B. Master-Mix-Lösung)5,9übernommen werden. Die Spezifität des Assays kann sich ändern, wenn er auf eine andere geografische Region angewendet wird, da der Test auf Proben aus einer neuen biotischen Gemeinschaft angewendet wird, die Nichtzielarten umfassen können, gegen die der Test nicht getestet wurde, und genetische Variationen in der Zielart auftreten können. Auch hier sollte der Test neu bewertet werden, wenn er an einem neuen Standort verwendet wird. Die Feldbedingungen unterscheiden sich von den Laborbedingungen, da pcR-Inhibitoren im Feld eher in Proben vorkommen. PCR-Inhibitoren wirken sich direkt auf die Amplifikationsreaktion aus und beeinflussen somit die Assay-Leistung. Aus diesem Grund ist bei der Entwicklung eines eDNA-Assays eine interne Positivkontrolle erforderlich.

Schließlich können Die Umweltbedingungen vor Ort die DNA-Moleküle der Zielart und ihre Erfassung durch DNA-Abbau, -Transport und -Retention beeinflussen. Darüber hinaus unterscheiden sich verschiedene Protokolle für die DNA-Sammlung und -Extraktion in ihrer Effizienz und Fähigkeit, DNA zu behalten. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Prozesse die Nachweisbarkeit von eDNA beeinflussen, aber nicht die Leistung eines molekularen Assays. Somit ist die Nachweisbarkeit der DNA aus der Zielart in Feldproben eine Funktion sowohl der technischen Leistung des qPCR-Assays als auch der Feldbedingungen und der Sammlungs-, Lager- und Extraktionsprotokolle. Bei der Verwendung eines gut charakterisierten und leistungsstarken Assays können Benutzer sich in die Fähigkeiten des Assays verlassen können. Die Forscher können sich nun auf das Verständnis der externen Assay-Faktoren (d. h. Umweltvariablen, Unterschiede in der Erfassung oder Extraktionsprotokolle) konzentrieren, die die eDNA-Erkennung beeinflussen.

Hier konzentrieren wir uns speziell auf die technische Leistung des Assays durch strenges Design und Optimierung. Wir demonstrieren das Protokoll mit einem sondenbasierten Assay, der für den Nachweis einer Süßwassermuschel, der Mucket (Actinonaias ligamentina), aus Wasser, das im Clinch River, USA, entnommen wurde, entwickelt wurde. Kürzlich haben Thalinger et al. (2020) Richtlinien zur Validierung gezielter eDNA-Assays vorgestellt. Das Assay-Design nach unserem Protokoll wird Thalinger et al. einen Test auf Stufe 4 sowie einen zusätzlichen Schritt in Richtung Stufe 56bringen. An dieser Stelle wird die technische Leistung eines Assays optimiert und für den regelmäßigen Einsatz in Labor- und Feldanwendungen bereitstehen. Der weitere Einsatz des Assays in Labor-, Mesokosmos- und Feldexperimenten kann dann Fragen zur eDNA-Detektion und zu Faktoren, die die Nachweisbarkeit beeinflussen, beantworten, die letzten Schritte für die Validierung der Stufe 56.

Protocol

1. Generierung einer Sequenzdatenbank mitochondrialer DNA-Sequenzen von Ziel- und Nichtzielarten von Interesse Definieren Sie die Frage, die Ziele und das System, das behandelt wird. Identifizieren Sie die Zielart für den eDNA-Nachweis. Identifizieren Sie das geografische System, in dem der Test verwendet wird. Erstellen Sie eine Liste der Arten von Interesse, einschließlich der Zielarten, sympatischer (mitvorkommender) Arten innerhalb derselben Taxa (in der Regel Ordnung oder Familienebene) und eng verwandter allopatricArten, die sich möglicherweise nicht am gleichen geografischen Ort wie das Ziel befinden (Abbildung 1).HINWEIS: Hier wurden die Clinch-Fluss-Populationen der Art A. ligamentina ins Visier genommen. Suchen und herunterladen Sie Sequenzen aus mehreren Genregionen nach Arten, die in der Liste aus Schritt 1 aufgeführt sind. Sequenzdatenbanken wie NCBI (National Center for Biotechnology Information), BOLD (Barcode of Life Database), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) und DDBJ (DNA Data Bank of Japan) können verwendet werden. NCBI, EMBL und DDBJ teilen alle Sequenzinformationen. Mithilfe der NcBI-Nukleotid-Datenbank nach dem Zielorganismus (z. B. Actinonaias ligamentina) und der Genregion (z. B. Cytochrom-c-Oxidase I (COI) oder NADH-Dehydrogenase 1 (ND1) suchen; Beispiel Suchzeichenfolge: Actinonaias ligamentina AND ND1) Wählen Sie als Nächstes alle Sequenzen aus, die den Spezifikationen entsprechen, und wählen Sie Senden an aus. Wählen Sie Datensatz , Datei und Downloadformat als GenBank oder FASTA und dann Datei erstellen. Diese Sequenzen werden nun auf dem Computer gespeichert. Wiederholen Sie diese Schritte für alle Arten in der Liste, die in Schritt 1 definiert sind. Bewahren Sie Sequenzen für jeden Genbereich in einer separaten Datei auf, da diese separat analysiert werden. Laden Sie alle relevanten Sequenzen (oder einen großen, repräsentativen Anteil der Sequenzen) für die in Schritt 1 identifizierten Zielarten herunter. Fügen Sie nach Möglichkeit geografische Varianten ein. Wiederholen Sie die Such- und Downloadsequenzen für verwandte und sympatische Nichtzielarten derselben taxonomischen Gruppe, die in Schritt 1 identifiziert wurden (z. B. wenn es sich bei der Zielart um die Mucket (A. ligamentina) Downloadsequenzen für alle anderen Süßwassermuschelarten in der Familie Unionidae handelt, die im Interessensystem vorkommen). Wiederholen Sie die Suche und den Download nach eng verwandten, aber allopatric (geographisch getrennten) Arten, die in Schritt 1.1 aufgeführt sind.HINWEIS: Nicht alle Arten (Ziele und Nicht-Ziele) werden in den öffentlichen Datenbanken verfügbar sein. Erhöhen Sie die lokale Referenzdatenbank, indem Sie taxonomisch verifizierte Exemplare von Arten von Interesse im eigenen Haus verstärken und sequenzieren. Wenn Sie mit einer Art arbeiten, die eine hohe genetische Vielfalt innerhalb der Art hat, oder in einem geografisch großen Gebiet arbeiten, in dem geografische Varianten zu erwarten sind, sammeln Sie Sequenzen aus dem gesamten Bereich. 2. Assay-Design Richten Sie Sequenzen aus jedem Genbereich separat mit Ausrichtungssoftware aus, die in verschiedenen genetischen Sequenzbearbeitungs- und Bioinformatikprogrammen zu finden ist. Machen Sie diese Ausrichtung für jede der verschiedenen Genregionen. Zum Beispiel importieren Sie mit der Software Geneious Prime (https://www.geneious.com) die heruntergeladenen Sequenzdateien in das Programm. Erstellen Sie separate Ordner für jede Genregion. Wählen Sie in einem Ordner, der Sequenzen aus einem Genbereich enthält, alle Sequenzen aus. Verwenden Sie das Werkzeug Mehrfachausrichtung, um eine Nukleotidausrichtung der ausgewählten Sequenzen zu erstellen. Es kann mehrere Optionen für den Typ der Ausrichtung geben, mit den Geneious oder MUSCLE Ausrichtungen und Standardparameter funktioniert gut. Wählen Sie vielversprechende Regionen für das Assay-Design durch die Visualisierung ausgerichteter Sequenzdaten aus. Eine Region, die viele Sequenzdaten für die Arten von Interesse zur Verfügung hat, ist sehr unterschiedlich zwischen den Arten, und zeigt eine geringe Innerhalb-Arten-Variation ist ein guter Kandidat. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass primer und sondierungsfähig sein werden, um das Ziel von Nicht-Zielarten zu unterscheiden, während gleichzeitig sichergestellt wird, dass sich intraspezifische Varianten mit dem Test verstärken. Design von Assay-Primern und Sonde.Verwenden Sie qPCR Assay Design Software und folgen Sie den Anweisungen. IdTs PrimerQuest Tool (https://www.idtdna.com/) zum Entwerfen von 5 Sets von qPCR-Assays wurde hier verwendet. Fügen Sie die in Schritt 2.2 ausgewählte Sequenz in das Sequenzeingabefeld ein. Wenn die Ausrichtung Räume erstellt hat, löschen Sie diese aus der Sequenz. Wählen Sie qPCR 2 Primers + Probe in der Option Wählen Sie Ihr Design aus. Laden Sie die empfohlenen Assays herunter. Kopieren Sie die Sequenzen aus der Vorwärtsgrundierung des ersten Assays, und suchen Sie nach dieser Primersequenz in der in Schritt 2.1.4 erstellten Ausrichtung. Wenn Sie Geneious Prime verwenden, verwenden Sie das Werkzeug Annotate und Predict, um der Ausrichtung den Primerbereich hinzuzufügen. Tun Sie dies für alle Primer- und Sondenkombinationen (Abbildung 2). Untersuchen Sie diese Bereiche der Ausrichtung auf Variationen innerhalb der Zielart sowie innerhalb der mitvorkommenden Arten. Wenn es intraspezifische genetische Variationen gibt, suchen Sie nach Assays, bei denen die Primer und die Sonde nicht in diese Regionen fallen. Um eine Amplifikation von Nichtzielarten zu verhindern, suchen Sie nach Inkongruenzen mit Nichtzielarten. Wählen Sie Assays mit den meisten Inkongruenzen für die weitere Validierung. Currier et al. (2018) schlagen vor, Sets mit mindestens zwei der drei Regionen (die beiden Primer oder eine Primer und eine Sonde) mit mindestens zwei Inkongruenzen mit allen Nichtzielarten auszuwählen. Beachten Sie jedoch, dass Inkongruenzen an der Sonde weniger zur Spezifitätbeitragen 10.ANMERKUNG: Unterschiede innerhalb von 3 Basispaaren des 3′-Endes jedes Primers erhöhen die Spezifität besser als Unterschiede am 5′ Ende der Primer10. Berücksichtigen Sie die folgenden wichtigen Parameter im Assay-Design. Bestimmen Sie die Schmelz- und Glühtemperaturen der Primer und Sonden. Idealerweise sollte die Schmelztemperatur (Tm) der Primer zwischen 60-64 °C und innerhalb von 2 °C liegen, und das Tm der Sonde sollte 6-8 Grad höher sein als das Tm der Primer. Stellen Sie die Glühtemperatur (Ta) der qPCR-Reaktion 5 °C unter die Schmelztemperatur, um 55-60 °C11. Untersuchen Sie den GC-Inhalt. Wählen Sie zwischen 35 – 65 % GC-Inhalt und vermeiden Sie Regionen mit 4 oder mehr aufeinander folgenden Gs. 1 oder 2 Gs oder Cs in den 5 letzten Basen des 3′ Endes des Primers (GC-Klemme) könnten die Spezifität erhöhen, da es dem Primer helfen würde, eine stärkere Bindung12zu machen. Suche nach Haarnadel- und Dimerstrukturen. Testprimer und Sonde für vorhergesagte Haarnadelstrukturen und Dimere mit einem Oligonukleotid-Analyseprogramm (z. B. OligoAnalyzer -IDT13; OligoCalculator14). Diese Strukturen können zu einer Nichtzielverstärkung und einer geringeren Effizienz führen. Vermeiden Sie Assays, die diese Strukturen voraussichtlich bilden werden. Bestimmen Sie die Grundierungslänge. Ziel für Primer zwischen 18-25 Basen in der Länge und Sondenlänge zwischen 20 –25 Basen. Längere Primer und Sonden können eine geringere Verstärkungseffizienz haben. Bestimmen Sie die Ampliconlänge. Es sollte zwischen etwa 100 und 250 Basenpaare sein. Dieser Bereich ist in der Regel kurz genug für eine hohe PCR-Effizienz, aber lang genug für eine einfache Überprüfung durch Sanger Sequenzierung4,15. Design-Sonden. Stellen Sie sicher, dass die Sonden keine G-Basis am 5′ Ende haben, da sie das Signal von grünen und gelben Farbstoffen11dämpfen könnte. Wir haben doppelt abgeschreckte Sonden mit IDT 3IABkFQ und ZEN-Quenchern und FAM- oder HEX-Fluorophoren entwickelt.HINWEIS: Bestimmen Sie die MGB-Sonden: TaqMan MGB (Minor Groove Bindemittel) Sonden werden häufig für eDNA-Studien verwendet. Da diese Sonden jedoch sehr kurz sind, können sie an Nicht-Ziele binden, selbst wenn ein 2- oder 3-Basispaar-Konflikt10. Bestimmen Sie die Sonde Tm. Die Schmelztemperatur der Sonde sollte 6-8°C höher sein als die Primer. Niedrigere Temperaturen verringern den Bindungserfolg der Sonde. Bestimmen Sie die Länge und den Standort der Sonde. Die Sonde sollte zwischen 20 und 25 bp lang sein und idealerweise in der Nähe der Primerbindungsstelle auf demselben Strang liegen, ohne sie zu überlappen. 3. Assay-Screening und -Optimierung In Silico Assay Entwicklung und Tests. Vor der Bestellung von Primer-Sonden-Sets, bewerten Sie die Spezifität (potenzielle Nicht-Ziel-Verstärkung), indem Sie die Primerverstärkung in Silicotesten. Testen Sie Primer über die Primer-Blast16 von NCBI oder ähnliche Programme, die potenzielle Nicht-Ziele in der NCBI nt/nr-Datenbank identifizieren können, die sich mit dem Test verstärken könnten. Wenn Sie Primer-Blast-Pastenprimer auf der Use my own primer box unter Primer-Parameterverwenden verwenden. Wählen Sie in den Optionen Primer Pair Specificity Checking Parameters nr als Datenbank aus und geben Sie die Reihenfolge des betreffenden Organismus (z. B. “Unionida” oder “Unionoida”) in das Feld Organismus ein. Fahren Sie mit der visuellen Bewertung von Primer-/Sondensätzen für ausgerichtete Sequenzdaten fort. Um Primer und Sonden gleichzeitig in Silico zu bewerten, erstellen Sie eine Textzeichenfolge des Vorwärtsprimers, 12 N’s, der Sonde, 12 N und der umgekehrten Komplementierung des umgekehrten Primers. Wenn die Sondensequenz innerhalb von 12 Basispaaren eines der Primer liegt, verwenden Sie die Anzahl der N’s, die der Anzahl der Basispaare zwischen Primer und Sonde entspricht. Verwenden Sie die Nukleotid-Blast-Suche (Blastn) von NCBI, um nach der nr-Datenbank17zu suchen. Verwenden Sie die Registerkarte Taxonomie, um nach Nichtzielarten mit wenigen Inkongruenzen zu suchen. Diese sollten im Labor während der Assay-Optimierung getestet werden.HINWEIS: Bei Silico-Tests wird dazu beigetragen, nicht-spezifische Assays auszuschließen, aber potenziell spezifische Assays müssen empirisch (in vitro) getestet werden, da nicht alle Arten Sequenzen in den genetischen Datenbanken haben und Primer und Sonden immer noch an Nicht-Ziele binden können, selbst wenn sie von der Software als unwahrscheinlich erachtet werden. Wählen Sie drei bis fünf Primer/Sonden-Kombinationen, um sie im Labor zu testen. Bestellen Sie Primer, Sonden und einen synthetischen DNA-Standard sowie zusätzliche M13-Tailed Primer für die Amplicon-Sequenzierung. Bestellen Sie synthetische Oligonukleotid-Primer und Sonden von einem Unternehmen, das Oligos herstellt. Die Sonden sind mit einem fluoreszierenden Farbstoff und einem Quencher gekennzeichnet. Für Assays, die multiplexiert werden müssen, sollten verschiedene Fluorophore ausgewählt werden. Überprüfen Sie Ihr qPCR-Instrument auf eine Liste, welche Fluorophore das Instrument erkennen kann. Design und Bestellung M13-tailed Primer zur Überprüfung von qPCR-Erkennungen mit Sanger-Sequenz durch Hinzufügen der M13 Forward (-20) Sequenz, GTA AAA CGA CGG CCA GT, zum 5′ Ende der Vorwärtsgrundierung und der M13 Reverse (-27) Sequenz, CAG GAA ACA GCT ATG AC, zum 5′ Ende des Rückwärtsgrundierungs. Der synthetische DNA-Standard enthält die Zielsequenz (einschließlich der Primerregionen) in einer bekannten Konzentration in Kopien/L. Quantifizieren Sie unbekannte Proben auf der Grundlage einer Kurve, die durch bekannte Konzentrationen dieses Standards (d. h. der Standardkurve) gemacht wurde. Erwerben Sie den synthetischen Standard von der gleichen Firma, die die Primer und Sonde herstellt. Befolgen Sie die Empfehlungen des Herstellers für Resuspension und Lagerung. Verdünnung von Standards im TE-Puffer mit einem tRNA-Träger mit retentionsarmen Kunststoffen, um die Hydrolyse und Bindung an Oberflächen zu reduzieren.HINWEIS: Wenn die Standardkurve nicht gut funktioniert (schlechte PCR-Effizienz, siehe Schritt 3.4.2), versuchen Sie, den Standard in Wasser oder Tris-HCl erneut aufzuhängen. Suspend primer and probes in nuklease free water, Tris-HCl, or TE buffer at convenient concentrations for assay use. Im Allgemeinen verdünnen Sie die Arbeitsbestände im Master-Mix um das 20-fache, um die optimierte End-Assay-Konzentration zu erreichen. Ausgesetzte Oligos bei nicht gebrauchend konstant -20 °C aufbewahren. In vitro (im Labor) Assay-Optimierung und -Tests. Ablehnen von Assays, die eine schlechte Effizienz haben, mit mitgemeinsam auftretenden Arten kreuz reagieren oder eine schlechte Empfindlichkeit haben18. Berücksichtigen Sie die Verwendung einer internen Positivkontrolle (IPC) während der Assay-Entwicklung sowie beim Ausführen tatsächlicher Proben.Finden Sie zunächst die optimalen Temperatur- und Primer/Sondenkonzentrationswerte für den Test. Sobald diese Parameter für PCR-Effizienz (Schritt 3.4.2), Cross-Reaktivität (Schritt 3.4.3) und Empfindlichkeit (Schritt 3.4.4) optimiert wurden, führen Sie den Test mit einem multiplexierten IPC (Schritt 3.4.5) aus. Testen Sie die optimale Glühtemperatur (Ta) für Primer und Sonden mit einem PCR-Temperaturgradienten, der um 5° C unter dem vorhergesagten durchschnittlichen Primer Tm zentriert ist. Testen Sie optimale Grund- und Sondenkonzentrationen. In der Regel werden 200 nM- und 800 nM-Primerkonzentrationen und 75 nM-, 125 nM- und 200 nM-Sondenkonzentrationen getestet. Erstellen Sie eine Standardkurve und bestimmen Sie Dieeffizienz und den linearen Bereich. Testen Sie mindestens sechs 10-fache Verdünnungen eines synthetischen DNA-Standards, der die Zielsequenz enthält, bei ca. 100 Kopien/Reaktion auf 105 Kopien/Reaktion (Abbildung 3A). Verwenden Sie die qPCR-Software, um den Cq-Wert (Schwellenwert für den Zyklus bei quantifizierung) jedes Standards auf der y-Achse und die Logbasis 10 der anfänglichen Standardkonzentration in Kopien/Reaktion auf der x-Achse darzustellen. Die qPCR-Software sollte automatisch eine lineare Regression ausführen (Abbildung 3B). Berechnen Sie die Effizienz aus der Steigung der Regression, E = -1 + 10(-1/Slope). Wenn die Steigung z. B. -3,4, E= -1 + 10(0,29) = 0,97 oder 97 % beträgt. Überprüfen Sie auch die r 2-Werte, die angeben, wie gut die Standardreplikationen auf die Kurve passen. Die qPCR-Software sollte dies auch automatisch berechnen (Abbildung 3B). Ziel für Effizienzwerte von 100% (±10%) und r2 Werte von ≥0.989,15,19,20,21,22. Überprüfen Sie die Standardkurve visuell auf Verzerrungen, d. h. Abweichungen von der Regression in konsistenter Richtung oder auf eine schlechte Standardkurvenleistung, gemessen anhand von Effizienz- und r2-Werten (Abbildung 3C und 3D). Spezifität: Bewerten Sie die Kreuzreaktivität mit Nichtzielarten, um die Wahrscheinlichkeit falschpositiver Ergebnisse zu verringern. Wenn eDNA-Erkennungen zu kostspieligen Managemententscheidungen führen können, überprüfen Sie positive Erkennungen durch Amplicon-Sequenzierung. Nicht-Ziele: Führen Sie den Test gegen genomische DNA-Extraktionen von taxonomisch verifizierten Proben verwandter Arten und geographisch mitvorkommender Arten durch; mit höchster Priorität, um eng verwandte, kovorkommende Arten zu testen. Verwenden Sie ähnliche Gesamt-DNA-Konzentrationen sowohl für Ziel- als auch für Nicht-Zielproben. Die gewählte Konzentration sollte eine Verstärkung aus Denkartenproben in der Mitte des linearen Bereichs der Standardkurve ergeben. Die Amplifikation sollte nur bei der Zielart beobachtet werden. Wenn eine Nichtzielverstärkung beobachtet wird, reinigen sie das Produkt, und sequenzieren Sie es, um seine Identität zu überprüfen. Es ist nicht ungewöhnlich, eine Kontamination der Zielart in Gewebeproben von Nichtzielarten zu beobachten, daher sollten alle Amplifikationen in diesem Stadium durch Sequenzierung überprüft werden. Reamplify gereinigte Amplicons aus Spezifitätstests mit den M13-Tailed Primern und Sequenz mit M13 Primern. Übertragen Sie im Post-PCR-Labor die zu sequenzierenden qPCR-Produkte in frische Schläuche. Entfernen Sie Restgrundierungen und Reaktionskomponenten mit einem Clean-up-Kit (z. B. MinElute PCR Purification Kit). Machen Sie 1:100 Verdünnungen der Elutionen und verstärken Sie jeweils 1 l für 30 Zyklen in einer 50-L-PCR-Reaktion mit den M13-Tailed Primern und einer Hochtreue-Polymerase (z. B. Phusion High-Fidelity DNA Polymerase). Führen Sie 10 l jeder Reaktion auf einem 1% Agarose-Gel aus, um ein einzelnes Band der erwarteten Größe zu überprüfen. Wenn kein Band beobachtet wird, erhöhen Sie die Anzahl der Zyklen oder die Menge der Probe. Wenn mehrere Bänder beobachtet werden, reinigt Gel das Band der erwarteten Größe. Entfernen Sie Restgrundierungen und Reaktionskomponenten mit einem Clean-up-Kit wie oben und messen Sie die DNA-Konzentrationen der Elutionen. Richten Sie Sequenzierungsreaktionen mit den M13-Primern gemäß den Anweisungen der Sequenzierungseinrichtung ein.HINWEIS: Öffnen Sie niemals verstärkte Proben im qPCR-Labor. Bereiten Sie Proben für die Sequenzierung in einem Labor vor, das post-PCR-Proben gewidmet ist. Empfindlichkeit: Sensitivität beeinflusst die Wahrscheinlichkeit falscher Negative oder Das Versagen, die DNA der Zielart zu erkennen, wenn sie vorhanden ist. Bewerten Sie die Nachweisgrenze (LOD) und die Quantifizierungsgrenze (LOQ) für jeden Test. Schließlich sollten Sie eine interne Positivkontrolle (IPC) zur Beurteilung der PCR-Hemmung von Proben einschließen. Multiplex und testen Sie diesen IPC-Assay mit dem entworfenen Assay, um sicherzustellen, dass die beiden Assays einander nicht stören. LOD: Machen Sie sechs 4-fache serielle Verdünnungen des synthetischen DNA-Standards, mit 8-24 Replikationen pro Standardverdünnung (Abbildung 4). Berechnen Sie die niedrigste Anfangskonzentration mit 95% Erkennung. LOD- und LOQ-Plots können mit einem LOD/LOQ-Rechner R-Skript5generiert werden.HINWEIS: Daten unterhalb der LOD sollten nicht zensiert werden. Aufgrund der Spezifität der PCR gibt es keine Untergrenze für echte Positivwerte. Die LOD ist die höchste Konzentration, unterhalb derer falsche Negative erwartet werden können. LOQ: Berechnen Sie aus der gleichen Verdünnungsreihe die niedrigste anfängliche DNA-Standardkonzentration, die mit einem Variationskoeffizienten (CV) unter 35 % quantifizierbar ist.HINWEIS: LOD und LOQ sollten in Kopien/Reaktion gemeldet werden. Bei Verwendung eines validierten Assays und Feldproben, die unterhalb des LOQ verstärken, sollten die Ergebnisse als %-Detektionen und nicht als eDNA-Konzentrationen gemeldet werden, da die genaue Konzentration nicht mit Vertrauen5gemessen werden kann. Verwenden Sie eine interne Positivkontrolle (IPC), um die PCR-Hemmung zu testen. Hemmung kann zu einer Abnahme der Empfindlichkeit und falschen Negativen führen. Testen Sie die Fähigkeit des IPC-Assays, mit dem Zieltest multiplexiert zu werden. Ein IPC-Assay kann mit dem Zieltest mit einer Sonde mit einem anderen Reporterfarbstoff als dem Zieltest multiplen. Dieser IPC-Assay besteht aus einer kurzen synthetischen DNA-Sequenz einer Spezies, die nicht mit der Zieltaxa verwandt ist und in den qPCR-Master-Mix mit einer geringen Konzentration von ca. 102 Kopien/Reaktion integriert ist, zusammen mit Primer und Sonden, die sie erkennen. Diese geringere Konzentration ist notwendig, um Denwettbewerb mit der Zielsequenz für Polymerase und Nukleotide23zu vermeiden. Vergleichen Sie den Cq-Wert der IPC-Vorlage des Beispiels mit dem der IPC-Vorlage im Steuerelement “Kein Vorlagen”. In diesem no template control (NTC) ist der einzige DNA-Eintrag der IPC-Vorlage. Die IPC-Vorlage in dieser Reaktion sollte sich wie erwartet verstärken. Wenn die IPC-Vorlage in einer Probe in 2 oder mehr Zyklen verstärkt wird, die sich von der IPC-Vorlage im NTC unterscheiden, wird die eDNA-Probe gehemmt. Proben, die eine Hemmung aufweisen, können 1:10 verdünnt und erneut getestet werden. Wenn eine Probe weiterhin gehemmt bleibt, sollte diese Probe aus der Analyse entfernt werden. In-situ-Assay-Entwicklung und -Tests Im Labor: Wenn der Zugang zum Organismus im Labor sowie sympatrische Arten zur Verfügung steht; Wasserproben aus Gehegen mit diesen Arten zu nehmen, die Proben zu verarbeiten und den Test mit diesen eDNA-Proben zu testen. Sequenzprodukte wie oben, um die Verstärkung des beabsichtigten Ziels mit den M13-Tailed Primern zu überprüfen. Im Feld: Identifizieren Sie Orte, an denen bekannt ist, dass der Zielorganismus auftritt und von denen nicht bekannt ist, dass sie auftreten. Es ist vorzuziehen, an jedem Ort, an dem die Zielart auftritt, ein gewisses Maß an Überfluss zu haben. Entscheiden Sie, welche Probenvolumina und Probenentnahmemethoden (z. B. Filtration, Zentrifugation usw.) verwendet werden. Fügen Sie ein Feld leer oder negativ Kontrolle an jedem Standort, dies ist sauberes Wasser, das auf das Feld-Site gebracht wurde und dann gesammelt und vorbereitet mit den gleichen Feldausrüstung und Protokolle für eDNA Probenahme24verwendet. Der Zweck des Feldrohlings besteht darin, eine Kontamination der probenahmemittel und der Feldausrüstung, die zum Einsatzort gebracht werden, zu erkennen. Nehmen Sie das Feld leer, bevor Sie Feldwasserproben verarbeiten. Nehmen Sie mehrere Wasserproben pro Standort, vorzugsweise 3 Proben pro Standort. Zurück im Labor, verarbeiten und extrahieren Sie Proben. Führen Sie den Test mit einer Platte aus, die Abbildung 5A ähnelt, und vergleichen Sie die eDNA-Konzentration und Detektionshäufigkeit mit bekannten Standortunterschieden in Vorkommen und Häufigkeit. Bestätigen Sie alle Erkennungen durch Sequenzierung24,25.HINWEIS: Die obigen bestätigen einen Test durch Stufe 4 der Stufe 4 der Stufe6 (2020) (Optimierung der technischen Leistung des Assays) und beginnen, Daten zu sammeln, die die Testvalidierung von Level 5 unterstützen. Stufe 5 beinhaltet wahrscheinliche Modellierung und Verwendung des Assays für eDNA-Ökologiestudien. Wir sind der Meinung, dass dies über den Rahmen der grundlegenden Assay-Entwicklung hinausgeht, aber wir fördern diese Anwendungen von Labor- und Feldprüftests, um das Assay-Design und die Dateninterpretation zu verbessern.

Representative Results

Bei der Gestaltung eines artspezifischen qPCR-Assays für die Mucket (A. ligamentina) wurden verfügbare Sequenzen aller Unionidae-Arten im Clinch-Fluss heruntergeladen. Eng verwandte Arten wie Lampsilis siliquoidea wurden ebenfalls in die Referenzdatenbank aufgenommen, obwohl sie nicht im selben Fluss gefunden werden. Nicht alle Arten im Flusssystem von Interesse wurden in GenBank gefunden, so dass zusätzliche Arten im Haus sequenziert wurden. Sequenzen wurden mit Geneious Software ausgerichtet und Primer Quest (IDT) Software wurde verwendet, um mehrere Assays zu entwerfen. Fünf Sätze von Primern und Sonden wurden der Ausrichtung für die visuelle Bewertung hinzugefügt (Abbildung 2). Sie wurden dann in Silico mit Primer-Blast getestet, danach wurden sie für weitere Tests in vitrobestellt. Im Labor wurden alle Assays mit DNA-Extraktionen von 27 verfügbaren Arten getestet, um die Spezifität zu überprüfen. Ein Assay (A.lig.1) hat nur die Zielart erfolgreich verstärkt(Tabelle 1; Tabelle 2). Dieser Test wurde für weitere Tests der Assay-Effizienz, LOD und LOQ vorwärts gebracht. Es hat eine Ampliconlänge von 121 Basenpaaren. Tabelle 3 zeigt die Sequenz, die für den synthetischen DNA-Standard A. ligamentina verwendet wird. Abbildung 3A und Abbildung 3B zeigen die Ergebnisse eines erfolgreichen Assays mit guter Effizienz und r2-Werten. Abbildung 3C und Abbildung 3D zeigen einen Assay, dessen Standardkurve einen schlechten Wirkungsgrad hat; dieser Test wurde verworfen. Die LOD und LOQ für den ausgewählten Test (A.lig.1) wurden beide als 5,00 Kopien/Reaktion mit der diskreten Methode in Klymus et al5beschrieben. Der IPC, der mit dem Assay (Tabellen 3-6) multiplet, hatte keinen Einfluss auf die Standardkurve des A. ligamentina assay. Das IPC, das wir verwenden, ist ein Fragment der Maus HemT Transkript. Dieser Test wurde von IDT für eine andere Anwendung vorentworfen, aber wir haben seine Verwendung als IPC für die eDNA-Anwendungen unseres Labors geändert. Ein erfolgreicher qPCR-Lauf sollte bestimmte Kriterien für jedes Leistungsmaß erfüllen (d. h. Standard-Kurvenverstärkung, genomische DNA-Positivkontrolle, keine Vorlagenkontrolle und interne Positivkontrolle). Die Ziel-Assay-Standards sollten exponentielle Verstärkungskurven aufweisen. Diese Kurven sollten ein Endpunktplateau erreichen, wenn genügend Zyklen ausgeführt werden dürfen. Dies deutet darauf hin, dass die Fluoreszenzsonde während der Reaktion vollständig verbraucht wird und die Fluoreszenzwerte eine maximale Grenze erreichen. Spätere Verstärkungsstandards erreichen möglicherweise nicht ein Plateau in 40 Zyklen. Die positiven Kontrollen (genomische DNA und IPC) sollten das gleiche Muster haben. Unbekannte können sich verstärken oder auch nicht, aber die Verstärkung bei Unbekannten sollte auch ein exponentielles Muster und ein Endpunktplateau aufweisen (Abbildung 5). In einer hochwertigen qPCR verstärken sich die Standardverdünnungen bei gleichmäßig verteiltem Cq von etwa allen 3,3 Zyklen für jeden 10-fachen Konzentrationsunterschied. Jede Replikation einer Standardverdünnung verstärkt sich in einer eng gruppierten Weise mit fast dem gleichen Cq (dargestellt durch die r 2-Werte). Alle Standardverdünnungen sollten eine Verstärkung aufweisen (Abbildung 3A). In einem schlechten qPCR können Standards eine nicht exponentielle Form aufweisen, ungleichmäßige Variationen der Cq-Werte zwischen Verdünnungen, kommen nicht zu einem Endpunktplateau, oder einige Verdünnungen können sich überhaupt nicht verstärken (Abbildung 3D). Die wichtigen Parameter für eine Standardkurve sind Effizienz, r2,Steigung und y-Abfangen. Die Effizienz sollte zwischen 90%-110% mit Idealwerten nahe 100% und r2 Werte sollten über 0,98 liegen, mit idealen Ergebnissen nahe 1,015,22. Neigungswerte sollten zwischen -3,2 und -3,5 liegen, mit idealen Ergebnissen in der Nähe von -3,322. Die y-Abfangwerte sollten zwischen einem Cq von 34-41 liegen, mit idealen Ergebnissen mit einem Cq von 37,0. Der y-Intercept ist der vorhergesagte Cq einer Reaktion mit 1 Kopie der Zielsequenz, der kleinsten Einheit, die in einem einzigen qPCR gemessen werden kann. Unbekannte mit Cqs größer als der y-Intercept sind wahrscheinlich gehemmt. Es kann notwendig sein, mehr als 40 Zyklen PCR zu laufen, um das Ziel im Falle einer Hemmung oder eines ineffizienten Primersatzes zu erkennen, jedoch ist eine Quantifizierung unter diesen Umständen nicht möglich, und zusätzliche negative Kontrollen ohne die Zielsequenz, aber mit der gesamten DNA ähnlich den Unbekannten, sollten ausgeführt werden, um eine Amplifikation aus nicht spezifischen Quellen auszuschließen. Die Verstärkung der Internen Positivkontrolle (IPC) in unbekannten Proben sollte mit den Ergebnissen der negativen Vorlagenkontrolle IPC verglichen werden, da es keinen Wettbewerb um Reagenzien gibt und keine Inhibitoren vorhanden sind. Unbekannte mit einem IPC mit einem Cq von 2 Zyklen oder größer als der durchschnittliche Cq-Wert des NTC, oder die nicht verstärken sollten als gehemmt betrachtet werden. Wenn in den Proben keine Inhibitoren vorhanden sind, sollte die gesamte IPC-Verstärkung eine enge Gruppierung im Diagramm mit Cq-Werten aufweisen, die dem NTC nahe stehen (Abbildung 6). Schließlich wurde der Test vor Ort getestet. Zwanzig Wasserproben aus dem Clinch River und drei Feld-Leerproben wurden zwischen dem 25. und 26. September 2019 im Umkreis von 500 Metern von einem Muschelbett gefiltert, von dem bekannt ist, dass es A. ligamentinahat. Pro Probenahmeort wurden etwa vier 1 L Wasserproben gefiltert. Lage Standorte am Boden des Muschelbettes im Bach, unten des Muschelbettes in Ufernähe, 100 m flussabwärts des Bettes im Bach, 500 m flussabwärts des Bettes in Bach und 500 m flussabwärts des Bettes in Ufernähe(Abbildung 7). Zurück im Labor wurde jeder Filter halbiert und DIE DNA wurde nur aus der Hälfte eines Filters extrahiert. Die restliche Filterhälfte für jede Probe wurde in einem -80 °C Gefrierschrank gelagert. Die Proben wurden dann mit dem A.lig.1-Assay-Multiplex mit dem IPC ausgeführt. Von den 23 Proben wurden fünf als gehemmt. Diese Proben wurden 1:10 verdünnt und Verdünnungen wurden erneut ausgeführt. Neunzehn der 20 Feldproben verstärkt mit dem entworfenen Assay. Von diesen 19 Proben lagen fünf über der LOD und LOQ des Assays von 5 Kopien/Reaktion; d. h. die meisten Proben hatten einen eDNA-Nachweis, aber auf einer Ebene, auf der falsche negative Ergebnisse wahrscheinlich auftreten können und dass der Test die Kopiernummer für diese 14 Proben nicht sicher quantifizieren konnte. Dennoch werden 75 bis 100 % der vier biologischen Standorte an jedem Probenahmeort verstärkt. Zwei der drei Feldrohlinge waren negativ, während ein Feldrohling eine Verstärkung zeigte, was die Bedeutung sauberer Technik im Feld betonte. Abbildung 1: Workflow für die Erstellung von mitochondrialen DNA-Sequenzdatenbanken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Sequenzausrichtungen für Clinch-Flussmuschelarten mit prospektiven Primern und Sonden für den Actinonaias ligamentina ND1-Assay. Vorwärtsgrundierungen in dunkelgrün, Sonde in Rot und Reverse Primer in hellgrün. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Beispiele für Standardkurven und lineare Regression. A. Beispiel für eine akzeptable Standardkurve, die aus der Verstärkung von drei Replikationen von jeweils sechs Standardverdünnungen abgeleitet wird. Eine 10-fache Standardverdünnungsserie mit der höchsten Konzentration des Standards auf der linken Seite, mit abnehmenden Konzentrationen, die sich nach rechts bewegen. Die horizontale Linie, die alle Spuren kreuzt, ist der Schwellenwert für den Zyklus bei der Quantifizierung (Cq). Wo jede Spur diesen Schwellenwert überschreitet, wird der Cq bestimmt. B. Lineare Regression aus den Standardreplikationen von Abbildung 3A. Replikationen der Standardverdünnungen werden im Kreis und die Unbekannten (Beispiele) mit x es geplottet. Der Wirkungsgrad beträgt 98,9 %, r2 nähert sich 1,0 und die Steigung beträgt -3,349. C. Beispiel für eine schlechte Standardkurve, die aus der Verstärkung von drei Replikationen von jeweils sechs Standardverdünnungen abgeleitet wurde. D. Eine lineare Regression, die die Standardkurve für die standardreplizierten In-Beispiel 3C bildet. Beachten Sie die schlechte Effizienz und r2 Werte. Beachten Sie auch, dass nur 4 der 6 Normen verstärkt. Wenn sich die Standardkurve nach Wiederholungsläufen nicht verbessert, kann das Problem bei einem schlechten Primer/Sondensatz liegen, der die Ziel-DNA nicht wie erwartet verstärkt, sollte dieser Test nicht berücksichtigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Beispiele für Platteneinstellungen für LOD- und LOQ-Standard-qPCR-Ausführungen. Die in der Kurve verwendeten Standards sind blau, die Standardkonzentration nimmt von dunkel auf hellblau ab. DNA-Positive-Kontrolle in grün und keine Vorlagenkontrolle (NTC) in Gelb. Experimentelle Standardkonzentrationen in Grau mit 24 Replikationen für jede Standardverdünnung. Die Verdünnungsserie wurde auf zwei Platten (A, B) mit jeweils einer Standardkurve, Einer Positivsteuerung und nTC plattiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Plattenaufbau- und Amplifikationsspuren aus einem qPCR-Lauf. A. Plattenaufbau, Standards in blauer, dunkler Farbe, die die höchste Konzentration des Standards anzeigt. DNA-Positive-Kontrolle in grün, keine Vorlagenkontrollen in gelb (NTC), Probenziele in grau. B. Verstärkungsspuren aus einem qPCR-Lauf. In blau dargestellte Standards, DNA-Positivkontrolle in Grün, keine Vorlagensteuerelemente in Gelb und Unbekannte in Rot. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Amplifikationsspuren für die Interne Positivkontrolle (IPC). IPC-Ablaufverfolgungen für alle unbekannten Samples in Magenta und den IPC aus den in Orange mit Dreiecken dargestellten No Template Controls (NTCs). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7: Karte mit den eDNA-Sammelstellen eines Muschelbettes im Clinch River entlang der Grenze zwischen Virginia und Tennessee. Proben wurden in Wallens Bend am Boden des Bettes, 100 m unterhalb des Bettes und 500 m unterhalb des Bettes gesammelt. Die Standorte wurden entweder in der Mitte des Baches (im Bach) oder etwa 1 – 2 Meter von der Küste (Ufer) gesammelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Komponente Namen Sequenz 5′ – 3′ Fluoreszierendes Etikett Vorwärts-Primer A.lig.1-f CCCTCATCACGTACCTCTTAATC Reverse Primer A.lig.1-r GGAATGCCCATAATTCCAACTTTA Sonde A.lig.1-Sonde TTCTTGAACGTAAAGCCCTCGGGT Fam Tabelle 1: Der entworfene Actinonaias ligamentina qPCR-Assay (A.lig.1) mit Sequenzen für die Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung und die Sonde. Spezies Verstärkt Im Clinch River 1. Actinonaias ligamentina Ja Ja 2. Actinonaias pectorosa Nein Ja 3. Amblema plicata Nein Ja 4. Corbicula spp. Nein Ja 5. Cumberlandia monodonta Nein Ja 6. Cyclonaias tuberculata Nein Ja 7. Cyprogenia stegaria Nein Ja 8. Elliptio dilatata Nein Ja 9. Epioblasma brevidens Nein Ja 10. Epioblasma capsaeformis Nein Ja 11. Epioblasma florentina aureola Nein Ja 12. Epioblasma triquetra Nein Ja 13. Fusconaia cor Nein Ja 14. Fusconaia subrotunda Nein Ja 15. Lampsilis ovata Nein Ja 16. Lampsilis siliquoidea Nein Nein 17. Lasmigona costata Nein Ja 18. Lemiox rimosus Nein Ja 19. Lexingtonia dolabelloides Nein Ja 20. Medionidus conradicus Nein Ja 21. Plethobasus cyphyus Nein Ja 22. Pleurobema Plenum Nein Ja 23. Ptychobranchus fasciolaris Nein Ja 24. Ptychobranchus subtentus Nein Ja 25. Quadrula pustulosa Nein Ja 26. Strophitus undulatus Nein Ja 27. Villosa iris Nein Ja Tabelle 2: Eine Liste der Arten, die für die In-vitro-Spezifitätsprüfung des A.lig.1-Tests verwendet werden. Der Assay verstärkte die genomische DNA des Ziels (Actinonaias ligamentina) und verstärkte keine der Nichtzielarten. Komponente Sequenz 5′-3′ Actinonaias ligementina Standard CCCTCATCACGTAC CTCTTAATCCTATTAGGTGTCGCATTTTTCACTCTTCTTGAACGTA AAGCCCTCGGGT ACTTTCAAATCCGAAAGGCCCAAATAAAGTTGGAATTATGGGCATTC CCCAACCATTAGCAGATGCTCTAAAGCTCTTCGTAAAAGAATGAGTAACACCAACCTCCT CAAACTACCTACCCCTATCTTAACCCCAACCACTATGTTAATTTTAGCACTTAGACTTT GACAATTATTTCCATCTTTTATTATCATCCCAAATANTTTTTGGTATGCTCCTATTCT TGTGTCTCTCTTCCCTAGCTGTTTATACACAACACTTATAACAGGCTGAGCCTCAAACTCCA AATATGCCCTTTTAGCTATTCGAGCCATAGCCCAAACCATTTCTTATGAGGTTACAA TAAC IPC-Vorlage (Hem-T) CTACATAAGTAACACTTCTCATGTCCAAAGCTCTCTGAGTGTCCCTCGAATCTCAGACGCT GTATGACAGTCTCTCTTTTCGTGTGAACATTCGGCTGCTCTATGTTCTCAAGGACTGCAC Tabelle 3: Sequenz (5′-3′) des Actinonaias ligamentina-Standards und der für diesen Test verwendeten IPC-Vorlage (Hem-T). Die Reihenfolge für die Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen ist fett und kursiv, und die der Sonde wird unterstrichen. Komponente Namen Sequenz 5′ – 3′ Fluoreszierendes Etikett Vorwärts-Primer HemT-F TCTGAGTGTCCCTCGAATCT Reverse Primer HemT-R GCAGTCCTTGAGAACATAGAGC Sonde HemT-P TGACAGTCTCTTTTCGTGTGAACATTCG Cy5 Tabelle 4: Der Internal Positive Control (IPC) Assay mit Sequenzen für die Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung und die Sonde. Volumen pro Probe (L) Komponente 10 Umwelt-Master-Mix 1 20uM A. lig.1 F/R Mischung 1 2.5uM A. lig.1 Sonde 1 5uM IPC Primer Mischung (HemT-F/ R) 0.75 2.5uM IPC Sonde (HemT-P) 1.5 1 X 103 Konzentration der IPC-Vorlage 2.75 H20 2 Beispiel 20 Gesamtvolumen Tabelle 5: Der PCR-Mix, der für den A.lig.1-Assay verwendet wird, wird mit dem IPC-Assay multipliziert. Schritt Temperatur (°C ) Zeit 1 Anfängliche Denatur 95 10 Min. 2 Denature 95 15 Sek. 3 Glühen 60 1 Min. 4 Gehen Sie zu Schritt 2, wiederholen Sie 39X Tabelle 6: Reaktionsbedingungen für den A.lig.1-Test.

Discussion

Wie bei jeder Studie ist die Definition der zu behandelnden Frage der erste Schritt, und die Gestaltung des eDNA-Tests hängt vom Umfang der Studie ab.26. Wenn beispielsweise das Ziel der Forschung oder Untersuchung darin besteht, eine oder mehrere Arten zu entdecken, ist ein gezielter, auf Sonden basierender Assay am besten. Wenn das Ziel jedoch darin besteht, eine größere Suite oder Zusammenstellung von Arten zu bewerten, sind Metabarcoding-Assays mit hohem Durchsatz besser geeignet. Sobald festgestellt ist, welchen Ansatz sie wählen soll, wird eine Pilotstudie mit Assay-Design, -Tests und -Optimierung empfohlen.24. Das Assay-Design beginnt mit einer Liste von Arten, wie in Abbildung 1. Diese Liste wird die Grundlage sein, um zu verstehen, wie gut ein Assay in Bezug auf die Spezifität und die geografische Reichweite, die er angewendet werden könnte,6,10. Es wird empfohlen, den Test für ein bestimmtes geografisches Gebiet zu entwerfen, damit der Konstrukteur einen Test auf Kreuzreaktivität gegen andere Arten in diesem Gebiet besser testen kann, und sich der Einschränkungen bewusst zu sein, die dies bei der Ausweitung eines Assays auf andere Gebiete mit sich führen kann, in denen eine Zielart auftreten kann.24. Sobald die Liste vollständig ist, können Sequenzen aus öffentlichen genetischen Datenbanken heruntergeladen werden. Da diese Datenbanken unvollständig sind,27sollte man so viele Arten wie möglich auf der Liste im Haus sequenzieren, um die lokale Referenzdatenbank der Sequenzen zu vervollständigen, die im Assay-Design verwendet werden. Priorisieren Sie ko-häufig auftretende Arten, da dies die wahrscheinlichsten Nicht-Ziele sind, die sich verstärken werden. Die Konzentration auf alle Arten innerhalb derselben Gattung oder Familie wie die Zielart ist ein guter Ausgangspunkt. Vergleiche mit eng verwandten Arten werden dazu beitragen, Sequenzregionen zu identifizieren, die für die Zielart einzigartig sind. Dies kann dazu beitragen, zu informieren, wie der Test in anderen Systemen oder Standorten funktionieren kann. Mitochondriale Regionen sind die übliche Wahl für die Assay-Entwicklung, weil mehr Sequenzinformationen aus einer größeren Vielfalt von Arten an mitochondrialen Genen verfügbar sind, die in Barcodes von Lebensprojekten verwendet wurden, und weil mitochondriale DNA in viel größerer Konzentration in Kopien/Zellen vorhanden ist als Kern-DNA24,28,29. Mehrere Genregionen sollten für die weitere Assay-Entwicklung bewertet werden, da die Sequenzabdeckung zwischen Taxa und den Datenbanken des genetischen Endlagers variiert. Nachdem diese lokale Datenbank mit Referenzsequenzen erstellt wurde, wird eine Kombination aus manueller Visualisierung ausgerichteter Sequenzdaten und Computersoftwareprogrammen verwendet, um die Primer/Probe-Assays zu entwerfen. Man sollte sich nicht streng auf Software verlassen, um zu bestimmen, welche Assays getestet werden sollen. Es ist wichtig, visuell auf Ausrichtungen zu überprüfen, bei denen die Primer und Sonden auf den Zielen und Nicht-Zielen sitzen, um ein besseres Verständnis dafür zu erhalten, wie sie in einer PCR handeln könnten. Schließlich umfasst assay Screening und Optimierung drei Ebenen (in Silico, In-vitro und in situ)6,7,24,25. In silico Design und Tests sind wichtig für die Erstellung einer kurzen Liste von Assays mit einer guten Chance auf Erfolg, aber empirische (in vitro) Tests ist entscheidend für die Auswahl des Tests mit der besten tatsächlichen Leistung. Die In-vitro-Optimierung und das Testen von Assays umfassen die Messung der Reaktionseffizienz und die Definition der Empfindlichkeit und Spezifität des Assays. Die Grenzen der Detektion und Quantifizierung sind zwei Parameter, die bei der Testentwicklung oft übersehen werden, aber für die Dateninterpretation wichtig sind. Durch Ausführen mehrerer Replikationen der Standardkurven für einen Assay können LOD und LOQ1,5,30. Nur wenige Studien diskutieren Ergebnisse in Bezug auf die LOD oder LOQ des Assays, aber Sengupta et al. (2019) integrieren LOD und LOQ ihres Assays in ihre Dateninterpretation und Grafik, um ihre Ergebnisse besser zu verstehen.31. Interne Positivkontrollen sollten auch in den entworfenen Assay einfließen. Ohne Tests auf PCR-Hemmung in den Proben können falsche Negative auftreten24,32. Wir schlagen die Verwendung eines multiplexierten IPC-Assays mit dem Zieltest als einfachste Methode für PCR-Hemmungstests vor.23. Schließlich ist eine In-situ-Prüfung des Assays aus Feld- und Laborproben erforderlich, um sicherzustellen, dass die Zielverstärkung in Umweltproben erfolgt.24.

Für die Verwendung artipeziesspezifischer, sonsweiter qPCR-Assays mit eDNA-Proben bestehen Einschränkungen. Beispielsweise kann das Design mehrerer Testtests durch die Verfügbarkeit von Sequenzen eingeschränkt werden, und es kann zu Kompromissen bei Aspekten der Assayleistung kommen. Diese Entscheidungen müssen sich an den Zielen der Studie orientieren und mit den Ergebnissen26gemeldet werden. Wenn das Ziel beispielsweise der Nachweis einer seltenen Art ist und nur wenige Positive erwartet werden, könnte ein Assay mit unvollkommener Spezifität (d. h. Verstärkung von Nichtzielarten) verwendet werden, wenn alle Detektionen durch Sequenzierung überprüft werden. Wenn das Ziel die Überwachung des geografischen Bereichs einer Art ist und eDNA-Konzentrationsdaten nicht benötigt werden, könnte ein Assay mit unvollkommener Effizienz verwendet und Daten nur als prozentuale Erkennung gemeldet werden. Darüber hinaus kann man, wenn nicht alle potentiellen Konspezifen im Labor getestet werden, was selten möglich ist, nicht mit absoluter Sicherheit die wahre Spezifität eines Assays kennen. Zum Beispiel wurde der Assay an mehreren Süßwassermuschelarten im Clinch River entwickelt und getestet. Um diesen Test in einem anderen Flusssystem zu verwenden, müssten wir ihn an einer Reihe von Arten am neuen Standort testen. Genetische Variation innerhalb der Art oder Population, die während der Assay-Entwicklung nicht getestet wird, könnte sich auch auf die Spezifität auswirken. Schließlich, selbst wenn ein Test auf eine hohe technische Leistung überprüft wurde; Bedingungen ändern sich, wenn Sie vor Ort arbeiten. Nicht-assay-bezogene Bedingungen wie Wasserdurchfluss, pH-Wert und Tierverhalten können die eDNA-Nachweisbarkeit ebenso verändern wie die Verwendung verschiedener eDNA-Sammlungs- und Extraktionsprotokolle. Die Verwendung von Assays, die optimiert und gut beschrieben sind, wird dazu beitragen, das Verständnis des Einflusses solcher Parameter auf die eDNA-Erkennung zu erleichtern.

Der Bereich der eDNA reift über das Stadium der explorativen Analyse hinaus zu einer zunehmenden Standardisierung von Methoden und Techniken. Diese Entwicklungen werden unser Verständnis von eDNA-Techniken, -Fähigkeiten und -Einschränkungen verbessern. Der Optimierungsprozess, den wir oben skizzieren, verbessert die Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit eines Assays. Das endliche Ziel dieser Verfeinerung und Standardisierung von eDNA-Methoden ist es, die Fähigkeiten der Forscher zu verbessern, Rückschlüsse auf der Grundlage von eDNA-Daten zu ziehen und das Vertrauen der Endnutzer und Der Stakeholder in die Ergebnisse zu erhöhen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Alvi Wadud und Trudi Frost, die bei der Entwicklung und Erprobung von Primer geholfen haben. Die Finanzierung des in dieser Studie berichteten Assay-Designs wurde vom Department of Defense Strategic Environmental Research and Development Program (RC19-1156) bereitgestellt. Jegliche Verwendung von Handels-, Produkt- oder Firmennamen dient nur zu beschreibenden Zwecken und impliziert keine Billigung durch die US-Regierung. Die während dieser Studie generierten Daten sind als USGS-Datenfreigabe https://doi.org/10.5066/P9BIGOS5 verfügbar.

Materials

96 Place Reversible Racks with Covers Globe Scientific 456355AST
Clean gloves (ie. latex, nitrile, etc.) Kimberly-Clark 43431, 55090
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855196
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 5408129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0mL Fisher Scientific 2681332
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear Bio-Rad #HSP9601
IPC forward and reverse primers Integrated DNA Technologies, Inc. none custom product
IPC PrimeTime qPCR Probes Integrated DNA Technologies, Inc. none custom product
IPC Ultramer DNA Oligo synthetic template Integrated DNA Technologies, Inc. none custom product
Labnet MPS 1000 Compact Mini Plate Spinner Centrifuge for PCR Plates Labnet C1000
Microcentrifuge machine Various – Any microcentrifuge machine that hold 1.5mL and 2.0mL tubes is typically okay.
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Invitrogen AM9932
Pipette Tips GP LTS 1000 µL F 768A/8 Rainin 30389272
Pipette Tips GP LTS 20 µL F 960A/10 Rainin 30389274
Pipette Tips GP LTS 200 µL F 960A/10 Rainin 30389276
Pipettes Rainin Various Depending on lab preference, manual or electronic pipettes can be used at various maximum volumes.
TaqMan Environmental Master Mix 2.0 Thermo Fisher Scientific 4396838
Target forward and reverse primers Integrated DNA Technologies, Inc. none custom product
Target PrimeTime qPCR Probes Integrated DNA Technologies, Inc. none custom product
Target synthetic gBlock gene fragment Integrated DNA Technologies, Inc. none custom product. used for qPCR standard dilution series
TE Buffer Invitrogen AM9849
VORTEX-GENIE 2 VORTEX MIXER Fisher Scientific 50728002
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Klymus, K. E., Ruiz Ramos, D. V., Thompson, N. L., Richter, C. A. Development and Testing of Species-specific Quantitative PCR Assays for Environmental DNA Applications. J. Vis. Exp. (165), e61825, doi:10.3791/61825 (2020).
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