Мульти-кий биореактор для оценки воспалительной и регенеративной способности биоматериалов в потоке и растяжении

Сердечно-сосудистая тканевая инженерия (ТЭ) рассматривается в качестве альтернативного варианта лечения используемым в настоящее время постоянным сердечно-сосудистым протезам (например, сосудистым трансплантатам, заменам сердечных клапанов), которые являются неоптимальными для больших когорт пациентов^1,2,3,4. К числу востребованных применений относятся тканеинженерные сосудистые трансплантаты (TEVG)^5,6 и сердечные клапаны (TEHV)^7,8. Чаще всего сердечно-сосудистые методологии ТЭ используют резорбируемые биоматериалы (природные или синтетические), которые служат поучительным каркасом для формирования новой ткани. Образование новой ткани может быть либо полностью спроектировано in vitro, путем засева каркаса клетками и культивирования в биореакторе перед имплантацией (in vitro TE)^9,10,11,либо непосредственно in situ, в котором синтетический каркас имплантируется без предварительного культивирования, чтобы индуцировать образование^новойткани непосредственно в организме (in situ TE)^12,13,14. Как для in vitro, так и для in situ сердечно-сосудистого ПОДХОДА TE успешная функциональная регенерация в доминирующей степени зависит как от иммунного ответа хозяина на имплантированную конструкцию, так и от соответствующей биомеханической нагрузки.

Важность биомеханической нагрузки для сердечно-сосудистой ТЭ хорошо признана^15. В случае сердечно-сосудистых имплантатов клетки, которые заполняют каркас, подвергаются циклическому растяжению и сдвиговым напряжениям, которые возникают в результате гемодинамической среды. Многочисленные исследования сообщали о стимулирующем влиянии (циклического) растяжения на образование компонентов матрицы, таких как коллаген^16,17,18,19,гликозаминогликаны (GAGs)²⁰и эластин^21,22,различными типами клеток. Например, Huang et al. продемонстрировали, что двухосное растяжение повышает отложение и организацию коллагена и эластина в TEVG in vitro с помощью сосудистого биореактора^23. В то время как акцент обычно делается на растяжении в качестве доминирующей нагрузки, в этих исследованиях часто используются биореакторы, управляемые потоком, в которых образец также подвергается сдвиговому потоку. Хотя относительно мало известно об изолированном влиянии сдвиговых напряжений на формирование тканей и воспаление в 3D, некоторые данные доступны. Например, Hinderer et al. и Eoh et al. продемонстрировали, что сдвиговой поток, в дополнение к микроструктуре 3D-каркаса, был важен для образования зрелого эластина клетками гладкой мускулатуры сосудов человека в модельной системе in vitro^24,25. В целом, эти результаты иллюстрируют актуальность как циклического растяжения, так и сдвигового стресса для сердечно-сосудистой ТЭ.

Другим важным фактором, определяющим успех или неудачу имплантатов TE, является иммунный ответ хозяина на имплантированный трансплантат^26. Это особенно важно для управляемых материалом стратегий IN situ TE, которые фактически полагаются на острую воспалительную реакцию на каркас, чтобы запустить последующие процессы клеточного притока и эндогенного образования и ремоделирования тканей^27. Макрофаг является критическим инициатором функциональной регенерации тканей, что было показано многочисленными исследованиями^28,29,30. По аналогии с заживлением ран, регенерация ткани регулируется паракринными сигналами между макрофагами и тканепродуцирующими клетками, такими как фибробласты и миофибробласты^31,32,33. Помимо координации отложений новых тканей, макрофаги участвуют в активном рассасывательном рассасывание чужеродного каркасного материала^34,35. Таким образом, реакция макрофагов in vitro на биоматериал была идентифицирована как прогностический параметр успеха in vivo имплантатов^36,37,38.

Реакция макрофага на имплантированный каркас зависит от конструктивных особенностей каркаса, таких как состав материала и микроструктура^35,39,40. В дополнение к свойствам каркаса, реакция макрофагов на каркас и их перекрестные помехи с миофибробластами также подвержена влиянию гемодинамических нагрузок. Например, было показано, что циклическое растяжение является важным модулятором фенотипа макрофагов^41,42,43,44 и секреции цитокинов^43,44,45,46 в 3D электроотращенные каркасы. Используя систему кокультуры макрофагов и гладкомышечных клеток сосудов, Battiston et al. продемонстрировали, что присутствие макрофагов привело к повышению уровня эластина и ГАГ и что умеренные уровни циклического растяжения (1,07–1,10) стимулировали отложение коллагена I и эластина^47. В предыдущих работах мы продемонстрировали, что напряжение сдвига является важным фактором, определяющим рекрутирование моноцитов в 3D-электроспыляющие каркасы^48,49,и что как напряжение сдвига, так и циклическое растяжение влияют на паракринную сигнализацию между моноцитами человека и мезенхимальными стромальными клетками^50. Fahy et al. продемонстрировали, что сдвиговой поток увеличивает секрецию провоспалительных цитокинов моноцитами человека^51.

Взятые вместе, приведенные выше данные показывают, что адекватное понимание и контроль гемодинамических нагрузок имеет решающее значение для сердечно-сосудистого ТЭ, и что для достижения этого важно учитывать воспалительную реакцию. Многочисленные биореакторы были описаны ранее для культуры сердечно-сосудистых тканей invitro^{52, 53, 54,55, 56,57,58} или ex vivo^59,60,61. Однако все эти системы предназначены для того, чтобы максимально имитировать физиологические условия гемодинамической нагрузки. Хотя это очень ценно для целей создания сердечно-сосудистых тканей in vitro или поддержания культур ex vivo, такие системы не позволяют систематически проводить исследования индивидуальных эффектов отдельных сигналов. Это связано с тем, что применение как циклического растяжения, так и напряжения сдвига в этих биореакторах обусловлено тем же потоком под давлением, который неразрывно связывает их. В то время как микросистемы, которые позволяют точно манипулировать несколькими сигналами, были описаны для 2D-подложек⁶² или 3D-гидрогелевых установок^63,64,такие установки не позволяют включать эластомерные 3D-биоматериальные каркасы.

Здесь мы представляем применение системы трубчатого биореактора, которая уникально позволяет разъединить напряжение сдвига и циклическое растяжение и помогает механистически исследовать их индивидуальные и комбинированные эффекты. Эта система позволяет тестировать широкий спектр тканеинженерных сосудистых трансплантатов (например, синтетического или природного происхождения, различной микроамхитектуры, различной пористости). Чтобы эффективно разъединить применение напряжения сдвига и растяжения, ключевыми концепциями, которые использует биореактор, являются (1) разделение контроля напряжения сдвига и растяжения с использованием различных насосных систем и (2) стимуляция лесов «наизнанку» с вычислительными размерами. Поток подается на внешнюю поверхность трубчатого каркаса с помощью проточного насоса, тогда как окружное растяжение каркаса индуцируется путем расширения силиконовой трубки, на которой установлен каркас с помощью отдельного тензометрического насоса. Размеры силиконовой трубки и стеклянной трубки, содержащей конструкцию, тщательно выбираются и проверяются с использованием вычислительного моделирования гидродинамики, чтобы гарантировать, что напряжение сдвига на каркасе (из-за потока) и окружное растяжение (из-за расширения трубы) существенно не влияют друг на друга. Этот дизайн имеет несколько практических обоснований. Если растяжение применяется давлением просветной жидкости (аналогично физиологической нагрузке), это по своей сути требует, чтобы конструкция образца была безтекания. Кроме того, давление, необходимое для растяжения образца, будет полностью определяться жесткостью образца, которая может варьироваться между образцами и внутри образца с течением времени, что затрудняет контроль растяжения. Этот биореактор монтирует тканеинженерный трансплантат вокруг силиконовой трубки и позволяет наносить напряжение сдвига стенки (WSS) на внешнюю стенку трансплантата и создавать давление на трансплантат изнутри. Таким образом, могут быть обеспечены равные условия нагрузки между образцами и внутри образцов с течением времени, и, кроме того, образцы допускаются к протекающей, как это характерно для пористых сосудистых каркасов^19. Этот биореактор специально предназначен для систематических исследований эффектов сдвига и / или растяжения, а не для инженерии нативного кровеносного сосуда in vitro, для которого более подходят традиционные настройки сосудистого биореактора. См. рисунок 1A–B для проектных чертежей биореактора и соответствующую таблицу 1 для функционального описания и обоснования основных компонентов биореактора.

Применение биореактора продемонстрировано на основе серии недавних исследований нашей группы, в которых мы исследовали индивидуальные и комбинированные влияния сдвигового напряжения и циклического растяжения на воспаление и образование тканей в рассасывающихся электроспыляемых каркасах для сердечно-сосудистой ткани in situ^19,43,44. С этой целью мы использовали человеческие макрофаги и миофибробласты либо в моно-, либо в кокультуре для моделирования различных фаз регенеративного каскада in situ. Мы продемонстрировали, что на секрецию цитокинов макрофагами человека отчетливо влияют как циклическое растяжение, так и напряжение сдвига, влияя на отложение матрицы и организацию миофибробластов человека в этих каркасах, как через паракринную сигнализацию, так и через прямой контакт^19,43,44. Примечательно, что эти исследования показали, что в случае комбинированного применения напряжения сдвига и растяжения влияние на формирование тканей и воспаление либо преобладает одна из двух нагрузок, либо существуют синергетические эффекты обеих нагрузок. Эти результаты иллюстрируют актуальность разъединения обеих нагрузок для лучшего понимания вклада механической среды в процессы ТЭ. Это понимание может быть применено для систематической оптимизации конструктивных параметров каркасов в соответствующих режимах гемодинамической нагрузки. Кроме того, механистические данные из таких хорошо контролируемых сред могут служить исходными данными для численных моделей, которые разрабатываются для прогнозирования хода ремоделирования тканей in situ, как недавно сообщалось для TEVG⁶⁵ или TEHVs^66,для дальнейшего улучшения прогностической способности.