Um Bioreator multi-cue para avaliar a capacidade inflamatória e regenerativa de biomateriais sob fluxo e estiramento

A engenharia de tecidos cardiovasculares (TE) está sendo perseguida como opção alternativa de tratamento às próteses cardiovasculares permanentes atualmente utilizadas (por exemplo, enxertos vasculares, substituições de válvulas cardíacas), que são subótimas para grandes coortes de pacientes^1,2,3,4. Aplicações muito procuradas incluem enxertos vasculares (TEVGs)^5,6 e válvulas cardíacas (TEHVs)^7,8. Na maioria das vezes, as metodologias cardiovasculares de TE fazem uso de biomateriais resorbáveis (naturais ou sintéticos) que servem como um andaime instrutivo para a formação do novo tecido. A formação de novos tecidos pode ser projetada completamente in vitro, semeando o andaime com células e culminando em um bioreator antes da implantação (te in vitro)^9,10,11, ou diretamente in situ, em que o andaime sintético é implantado sem pré-cultivo, a fim de induzir a formação de novos tecidos diretamente no corpo (in situ TE)^12,13,14. Tanto para abordagens in vitro quanto in situ cardiovascular TE, a regeneração funcional bem sucedida é predominantemente dependente tanto da resposta imune do hospedeiro à construção implantada quanto do carregamento biomecânico adequado.

A importância do carregamento biomecânico para te cardiovascular é bem reconhecida¹⁵. No caso dos implantes cardiovasculares, as células que povoam o andaime são expostas ao estiramento cíclico e estresses de cisalhamento que surgem como resultado do ambiente hemodinâmico. Inúmeros estudos têm relatado o efeito estimulante do estiramento (cíclico) na formação de componentes matriciais, como o colágeno^16,17,18,19, glicosaminoglicas (GAGs)²⁰e elastina^21,22, por vários tipos de células. Por exemplo, Huang et al. demonstraram que o estiramento biaxial elevou a deposição e organização do colágeno e da elastina em TEVGs in vitro usando um bioreator vascular²³. Embora a ênfase tipicamente reside no alongamento como a carga dominante, esses estudos muitas vezes fazem uso de bioreatores orientados pelo fluxo em que a amostra também é exposta ao fluxo de cisalhamento. Embora relativamente pouco se saiba sobre a influência isolada das tensões de tesoura na formação de tecidos e inflamação em 3D, alguns dados estão disponíveis. Por exemplo, Hinderer et al. e Eoh et al. demonstraram que o fluxo de cisalhamento, além de uma microestrutura de andaime 3D, foi importante para a formação de elastina madura por células musculares vasculares humanas em um sistema de modelo in vitro^24,25. Ao todo, esses achados ilustram a relevância tanto do alongamento cíclico quanto do estresse de cisalhamento para te cardiovascular.

Outro determinante importante para o sucesso ou falha dos implantes de TE é a resposta imune do hospedeiro ao enxerto implantado²⁶. Isso é particularmente importante para estratégias de TE in situ in situ, que realmente contam com a resposta inflamatória aguda ao andaime para iniciar os processos subsequentes de influxo celular e formação de tecido endógeno e remodelação²⁷. O macrófago é um iniciador crítico da regeneração do tecido funcional, que tem sido mostrado por múltiplos estudos^28,29,30. Análoga à cicatrização de feridas, a regeneração do tecido é regida pela sinalização paracrina entre macrófagos e células produtoras de tecidos, como fibroblastos e miofibroblasts^31,32,33. Além de coordenar a nova deposição tecidual, os macrófagos estão envolvidos na resorção ativa do material do andaime estrangeiro^34,35. Como tal, a resposta in vitro de macrófago a um bioma material foi identificada como parâmetro preditivo para o sucesso in vivo dos implantes^36,37,38.

A resposta do macrófago a um andaime implantado depende de características de design de andaimes, como composição de material e microestrutura^35,39,40. Além das propriedades do andaime, a resposta do macrófago a um andaime e seu crosstalk com myofibroblasts também é impactada por cargas hemodinâmicas. Por exemplo, o estiramento cíclico mostrou-se um importante modulador do fenótipo macrófago^41,42,43,44 e a secreção de citocinas^43,44,45,46 em andaimes eletroscardos 3D. Utilizando um sistema de co-cultura de macrófagos e células musculares lisas vasculares, Battiston et al. demonstraram que a presença de macrófagos levou ao aumento dos níveis de elastina e GAGs e que níveis moderados de estiramento cíclico (1,07-1,10) estimularam a deposição do colágeno I e elastina⁴⁷. Em trabalhos anteriores, demonstramos que o estresse da cisalhamento é um importante determinante para o recrutamento de monócitos em andaimes eletroscados^{3D 48,49}, e que tanto o estresse da cisalhamento quanto o estiramento cíclico impactam a sinalização paracrina entre monócitos humanos e células estrômicas mesenquimais⁵⁰. Fahy et al. demonstraram que o fluxo de cisalhamento aumentou a secreção de citocinas pró-inflamatórias por monócitos humanos⁵¹.

Em conjunto, as evidências acima mostram que uma compreensão adequada e controle sobre cargas hemodinâmicas é crucial para o TE cardiovascular, e que é importante considerar a resposta inflamatória para conseguir isso. Inúmeros bioreatores foram descritos anteriormente para a cultura in vitro^{52,53,54,55,56,57,58} ou ex vivo^59,60,61 cultura de tecidos cardiovasculares. No entanto, todos esses sistemas são projetados para imitar as condições fisiológicas de carregamento hemodinâmico tanto quanto possível. Embora isso seja altamente valioso para o propósito de criar tecidos cardiovasculares in vitro ou manter culturas ex vivo, tais sistemas não permitem estudos sistemáticos sobre os efeitos individuais das pistas individuais. Isso ocorre porque a aplicação tanto do estresse cíclico quanto do cisalhamento nesses bioreatores é impulsionada pelo mesmo fluxo pressurizado, que os liga intrinsecamente. Embora microsistemas que permitam manipulação mecânica precisa de várias pistas tenham sido descritos para substratos^{2D configurações de} hidrogel 62 ou 3D^63,64, tais configurações não permitem a incorporação de andaimes biomateriais 3D elastoméricos.

Aqui, apresentamos a aplicação de um sistema bioreator tubular que permite exclusivamente o desacoplamento do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico e ajuda a investigar mecanicamente seus efeitos individuais e combinados. Este sistema permite testar uma ampla variedade de enxertos vasculares projetados por tecido (por exemplo, origem sintética ou natural, microarquiteção diferente, várias porosidades). Para efetivamente desacoplar a aplicação do estresse e do alongamento da tesoura, os conceitos-chave que o bioreator usa são (1) separação do controle do estresse e do estiramento da tesoura usando sistemas de bomba distintos e (2) estimulação dos andaimes de forma “de dentro para fora” com dimensões computacionalmente orientadas. O fluxo é aplicado na superfície externa do andaime tubular através do uso de uma bomba de fluxo, enquanto o trecho circunferencial do andaime é induzido pela expansão de um tubo de silicone no qual o andaime é montado através do uso de uma bomba de tensão separada. As dimensões do tubo de silicone e do tubo de vidro que contém a construção são cuidadosamente escolhidas e validadas por meio de simulações de dinâmica computacional de fluidos, para garantir que o estresse da cisalhamento no andaime (devido ao fluxo) e o estiramento circunferencial (devido à expansão do tubo) não afetem significativamente uns aos outros. Este design de dentro para fora tem várias lógicas práticas. Se o estiramento for aplicado pela pressão do fluido luminal (semelhante ao carregamento fisiológico), ele requer inerentemente que o desenho da amostra seja livre de vazamentos. Além disso, a pressão necessária para esticar a amostra seria completamente determinada pela rigidez amostral, que pode variar entre amostras e dentro de uma amostra ao longo do tempo, dificultando o controle do trecho. Este bioreator monta o enxerto de tecido projetado em torno de um tubo de silicone e permite a aplicação de estresse de corte de parede (WSS) na parede externa do enxerto e pressuriza o enxerto por dentro. Dessa forma, condições iguais de carregamento entre amostras e dentro das amostras ao longo do tempo podem ser garantidas, e, além disso, as amostras podem ser vazadas, como é comum para andaimes vasculares porosos¹⁹. Este bioreator de dentro para fora destina-se especificamente a estudos sistemáticos sobre os efeitos da tesoura e/ou alongamento, em vez da engenharia de um vaso sanguíneo nativo in vitro, para o qual as configurações tradicionais de bioreatores vasculares são mais adequadas. Consulte a Figura 1A-B para os desenhos de design bioreator, e sua tabela correspondente 1 para uma descrição funcional e racionalidade por trás dos principais componentes do bioreator.

O uso do bioreator é demonstrado com base em uma série de estudos recentes do nosso grupo em que investigamos as influências individuais e combinadas do estresse da cisalhamento e do estiramento cíclico na inflamação e formação tecidual em andaimes eletrosopunis resorbáveis para in situ tecido cardiovascular^19,43,44. Para isso, usamos macrófagos humanos e miofibroblasts em mono ou em co-cultura para simular as várias fases da cascata regenerativa in situ. Demonstramos que a secreção de citocinas por macrófagos humanos é claramente impactada tanto pelo estresse do estiramento cíclico quanto pelo cisalhamento, afetando a deposição matricial e a organização por myofibroblasts humanos nestes andaimes, tanto via sinalização paracririna quanto pelo contato direto^19,43,44. Notavelmente, esses estudos revelaram que, no caso da aplicação combinada de estresse e alongamento da tesoura, os efeitos na formação e inflamação tecidual são dominados por uma das duas cargas, ou há efeitos sinérgicos de ambas as cargas. Esses achados ilustram a relevância da desacoplamento de ambas as cargas para obter uma melhor compreensão da contribuição do ambiente mecânico nos processos de TE. Esse entendimento pode ser aplicado para otimizar sistematicamente parâmetros de design de andaimes em regimes de carregamento hemodinâmicos relevantes. Além disso, os dados mecanicistas de ambientes tão bem controlados podem servir de entrada para modelos numéricos que estão sendo desenvolvidos para prever o curso da remodelação de tecidos in situ, como relatado recentemente para TEVGs⁶⁵ ou TEHVs⁶⁶, para melhorar ainda mais a capacidade preditiva.