フローとストレッチの下でバイオ材料の炎症と再生能力を評価するマルチキューバイオリアクター

心臓血管組織工学(TE)は、患者^{1、2、3、4}の大コホートに最適でない現在使用されている永久的な心臓血管補修(例えば、血管移植片、心臓弁置換術)に対する代替治療選択肢として追求されている。多くの求められているアプリケーションは、組織工学的に設計された血管移植片(TEVGs)5、6および心臓弁(TEHV)7、8を含む。ほとんどの場合、心臓血管TEの方法論は、新しい組織が形成される有益な足場として機能する再ソーブルバイオマテリアル(天然または合成のいずれか)を利用する。新しい組織の形成は、細胞で足場を播種し、移植前にバイオリアクターで培養することによって完全にインビトロで設計することができる(in vitro^{TE)9、10、11、}または合成足場が体内に新しい組織の形成を直接誘導するために前培養せずに移植されるその中で直接(situ TEにおいて)^{12,12, 13.}in vitroとininin心臓血管TEアプローチの両方について、機能的再生の成功は、移植された構築物に対する宿主免疫応答および適切な生体力学的負荷の両方に主に依存する。

心血管TEのための生体力学的負荷の重要性は、十分に認められている¹⁵.心臓血管インプラントの場合、足場に入る細胞は、血行力学的環境の結果として生じる周期的なストレッチおよびせん断ストレスにさらされる。多くの研究は、様々な細胞タイプによる、例えばコラーゲン^{16、17、18、19、}グリコサミノグリカン(GAGs)20、およびエラスチン^21、22、などのマトリックス成分の形成に対する(環状)ストレッチの刺激効果を報告している。例えば、Huang et al. は、二軸ストレッチが血管バイオリアクター²³を用いてインビトロTEVGsにおけるコラーゲンおよびエラスチンの堆積および組織を上昇させたことを実証した。主な負荷として強調される一方で、これらの研究は、多くの場合、サンプルがせん断流に曝露されるフロー駆動のバイオリアクターを利用しています。シアストレスが3Dの組織形成や炎症に及ぼす孤立した影響については比較的ほとんど知られていないが、いくつかのデータが利用可能である。例えば、ヒンダーらおよびEohら.は、剪断流が、3D足場微細構造に加えて、インビトロモデルシステム^24、25におけるヒト血管平滑筋細胞による成熟エラスチンの形成にとって重要であることを実証した。全体として、これらの知見は、心血管TEの環状ストレッチとせん断ストレスの両方の関連性を示している。

TEインプラントの成功または失敗に対するもう一つの重要な決定要因は、移植された移植片²⁶に対する宿主の免疫応答である。これは、細胞流入および内因性組織形成および再モデリング²⁷のその後のプロセスを開始するために足場に対する急性炎症反応に実際に依存する、その中での物質駆動のTE戦略にとって特に重要である。マクロファージは、機能的組織再生の重要なイニシエータであり、複数の研究^28、29、30によって示されている。創傷治癒に類似して、組織の再生は、マクロファージと線維芽細胞と筋線維芽細胞^31、32、33などの組織産生細胞との間のパラクリンシグナル伝達によって支配される。新しい組織堆積の調整に加えて、マクロファージは、外来足場材料^34、35の活性再吸収に関与している。このように、生体材料に対するインビトロマクロファージ応答は、インプラント^36、37、38の生体内成功の予測パラメータとして同定されている。

埋め込まれた足場に対するマクロファージ応答は、材料組成および微細構造^35、39、40などの足場設計特徴に依存^する。足場の特性に加えて、足場に対するマクロファージ応答および筋線維芽細胞とのクロストークも血行力学的負荷の影響を受ける。例えば、環状ストレッチは、マクロファージ表現型^{41、42、43、44}およびサイトカイン43、44、45、46の分泌の重要なモジュレーターであることが示された。マクロファージと血管平滑筋細胞の共培養システムを用いて、Battistonらは、マクロファージの存在がエラスチンおよびGAGのレベルの増加につながり、適度なレベルの環状ストレッチ(1.07-1.10)がコラーゲンIおよびエラスチン⁴⁷の沈着を刺激することを実証した。これまでの研究では、剪断応力が3Dエレクトロスパン足場^48,49への単球採用にとって重要な決定要因であり^、剪断応力と環状ストレッチの両方がヒト単球と間葉間質細胞⁵⁰との間のパラクリンシグナル伝達に影響を及ぼすことを実証した。Fahy et al. は、剪断流がヒト単球⁵¹による炎症性サイトカインの分泌を増加することを実証した。

まとめると、上記の証拠は、血行力学的負荷の十分な理解と制御が心血管TEにとって重要であり、これを達成するために炎症反応を考慮することが重要であることを示しています。多数のバイオリアクターが、心血管組織のinvitro 52、53、54、55、56、57、58またはex vivo ^59、60、61培養物について以前に説明されている。しかし、これらのシステムはすべて、可能な限り生理学的な血行負荷条件を模倣するように設計されています。これは、体外で心血管組織を作成したり、エキビボ培養を維持する目的で非常に貴重であるが,そのようなシステムは、個々の手がかりの個々の効果に体系的な研究を可能にしません.これは、これらのバイオリアクターにおける環状ストレッチとせん断応力の両方の適用は、本質的にそれらをリンクする同じ加圧流によって駆動されるためです。正確なマルチキュー機械操作を可能にするマイクロシステムは、2D基板⁶²または3Dハイドロゲルセットアップ^63、64のために記述されているが^、そのようなセットアップは、エラストマー3D生体材料足場の組み込みを可能にしていない。

ここでは、せん断応力と環状ストレッチの分離を独自に可能にし、個々の効果と組み合わせた効果を機械論的に調査するのに役立つ管状バイオリアクターシステムの適用を提示する。このシステムは、多種多様な組織工学的に設計された血管移植片(例えば、合成または天然起源、異なるマイクロアーキテクチャ、様々な多孔質)の試験を可能にする。せん断応力とストレッチの適用を効果的に切り離すために、バイオリアクターが使用する重要な概念は、(1)異なるポンプシステムを使用したせん断応力とストレッチの制御の分離と(2)計算駆動寸法を持つ「インサイドアウト」方式で足場の刺激です。流れは流れポンプの使用によって管状足場の外面に適用され、足場の周伸張は、足場が別のひずみポンプを使用して取り付けられるシリコーン管を拡大することによって誘発される。シリコンチューブと構成体を含むガラス管の寸法は、スキャフォールド(流れによる)と周伸縮(チューブ膨張による)のせん断応力が互いに大きな影響を与えないようにするために、計算流体力学シミュレーションを使用して慎重に選択され、検証されます。この裏返しの設計には、いくつかの実用的な根拠があります。ストレッチが(生理学的負荷に似た)発光流体圧力によって適用される場合、サンプル設計は本質的に漏れのないものでなければなりません。さらに、サンプルの伸張に必要な圧力は、サンプルの剛性によって完全に決定され、サンプル間およびサンプル内で時間の経過とずれによって変化し、ストレッチの制御が困難になります。このバイオリアクターは、シリコーンチューブの周りに組織工学的に設計された移植片を取り付け、移植片の外壁に壁せん断応力(WSS)の適用を可能にし、内部から移植片を加圧する。このようにして、サンプルとサンプル内の間の等しい負荷条件を時間をかけて確保することができ、また、多孔性血管足場¹⁹に対して一般的であるように、サンプルが漏れやすい状態が許される。この内部出力バイオリアクターは、従来の血管バイオリアクターのセットアップがより適しているインビトロのネイティブのような血管のエンジニアリングではなく、せん断および/またはストレッチの効果に関する体系的な研究のために特に意図されています。バイオリアクター設計図面の 図1A-B およびそれに対応する 表1 を参照して、バイオリアクターの主要成分の背後にある機能の説明と根拠を確認してください。

バイオリアクターの使用は、我々は、その現場の心血管組織^19、43、44における再ソーブルエレクトロスパン足場における炎症および組織形成に関する剪断ストレスおよび環状ストレッチの個々および組み合わせた影響を調査した我々のグループによる一連の最近の研究に基づいて実証される。そのために、ヒトマクロファージと筋線維芽細胞をモノ培養または共培養で使用して、イン・シチュの再生カスケードの様々な相をシミュレートしました。ヒトマクロファージによるサイトカイン分泌は、周期的な伸縮とせん断応力の両方によって明らかに影響を受け、これらの足場におけるヒト筋線維芽細胞によるマトリックス沈着および組織に影響を及ぼすことを実証^した。特に、これらの研究は、せん断応力とストレッチの併用の場合、組織形成および炎症への影響が2つの負荷のいずれかによって支配されるか、または両方の負荷の相乗効果があることを明らかにした。これらの知見は、両方の負荷を分離して、TE プロセスにおける機械的環境の寄与をより深く理解する関連性を示している。この理解は、関連する血行負荷のレジームでスキャフォールド設計パラメータを体系的に最適化するために適用できます。さらに、このような十分に制御された環境からの機械化データは、TEV65またはTEHV66に対して最近報告されているように、その場での組織改修の経過を予測するために開発されている数値モデルの入力として役立つ可能性があり、予測能力をさらに向上させる。