Un bioreattore multi-cue per valutare la capacità infiammatoria e rigenerativa dei biomateriali sotto flusso e allungamento

L’ingegneria tissutale cardiovascolare (TE) viene perseguita come opzione di trattamento alternativa alle protesi cardiovascolari permanenti attualmente utilizzate (ad esempio, innesti vascolari, sostituzioni delle valvole cardiache), che non sono ottimali per grandi coorti di^{pazienti 1,2,3,4.} Applicazioni molto ricercate includono innesti vascolari ingegnerizzati tissutale (TEVG)^5,6 e valvole cardiache (TEHV)^7,8. Molto spesso, le metodologie TE cardiovascolari fanno uso di biomateriali riassorbibili (naturali o sintetici) che fungono da impalcatura istruttiva per la formazione del nuovo tessuto. La formazione di nuovo tessuto può essere ingegnerata completamente in vitro, seminando l’impalcatura con cellule e coltivando in un bioreattore prima dell’impianto (TE in vitro)^9,10,11,o direttamente in situ, in cui l’impalcatura sintetica viene impiantata senza pre-coltura al fine di indurre la formazione di nuovo tessuto direttamente nel corpo (in situ TE)^12,13,14. Per gli approcci TE cardiovascolari sia in vitro che in situ, il successo della rigenerazione funzionale dipende prevalentemente sia dalla risposta immunitaria dell’ospite al costrutto impiantato che dal carico biomeccanico appropriato.

L’importanza del carico biomeccanico per il TE cardiovascolare è ben nota¹⁵. Nel caso di impianti cardiovascolari, le cellule che popolano l’impalcatura sono esposte a tensioni cicliche di allungamento e taglio che sorgono a seguito dell’ambiente emodinamico. Numerosi studi hanno riportato l’effetto stimolante dell’allungamento (ciclico) sulla formazione di componenti della matrice, come il collagene^16,17,18,19,i glicosaminoglicani (GAG)^20,e l’elastina^21,22,da parte di vari tipi di cellule. Ad esempio, Huang et al. hanno dimostrato che l’allungamento biassiale ha elevato la deposizione e l’organizzazione di collagene ed elastina nei TEVG in vitro utilizzando un bioreattore^{vascolare 23}. Mentre l’enfasi si trova in genere sull’allungamento come carico dominante, questi studi spesso fanno uso di bioreattori guidati dal flusso in cui il campione è anche esposto al flusso di taglio. Sebbene si sa relativamente poco sull’influenza isolata delle sollecitazioni di taglio sulla formazione dei tessuti e sull’infiammazione in 3D, alcuni dati sono disponibili. Ad esempio, Hinderer et al. e Eoh et al. hanno dimostrato che il flusso di taglio, oltre a una microstruttura 3D dello scaffold, era importante per la formazione di elastina matura da parte delle cellule muscolari lisce vascolari umane in un sistema modello in vitro^24,25. Complessivamente, questi risultati illustrano la rilevanza sia dello stretching ciclico che dello stress da taglio per il TE cardiovascolare.

Un altro importante fattore determinante per il successo o il fallimento degli impianti TE è la risposta immunitaria dell’ospite all’innesto impiantato²⁶. Ciò è particolarmente importante per le strategie TE in situ guidate dal materiale, che in realtà si basano sulla risposta infiammatoria acuta all’impalcatura per avviare i successivi processi di afflusso cellulare e formazione e rimodellamento del tessuto endogeno²⁷. Il macrofago è un iniziatore critico della rigenerazione funzionale dei tessuti, che è stato dimostrato da più studi^28,29,30. Analogamente alla guarigione delle ferite, la rigenerazione del tessuto è governata dalla segnalazione paracrina tra macrofagi e cellule produttrici di tessuti come fibroblasti e miofibroblasti^31,32,33. Oltre a coordinare la deposizione di nuovi tessuti, i macrofagi sono coinvolti nel riassorbimento attivo del materiale estraneo dell’impalcatura^34,35. Come tale, la risposta dei macrofagi in vitro a un biomateriale è stata identificata come parametro predittivo per il successo in vivo degli impianti^36,37,38.

La risposta dei macrofagi a un’impalcatura impiantata dipende dalle caratteristiche di progettazione dell’impalcatura come la composizione del materiale e la microstruttura^35,39,40. Oltre alle proprietà dell’impalcatura, anche la risposta dei macrofagi a un’impalcatura e la loro diafonia con i miofibroblasti è influenzata dai carichi emodinamici. Ad esempio, l’allungamento ciclico ha dimostrato di essere un importante modulatore del fenotipo macrofagico^41,42,43,44 e della secrezione di citochine^43,44,45,46 in scaffold elettrofilati 3D. Utilizzando un sistema di co-coltura di macrofagi e cellule muscolari lisce vascolari, Battiston et al. hanno dimostrato che la presenza di macrofagi ha portato ad un aumento dei livelli di elastina e GAG e che livelli moderati di allungamento ciclico (1,07-1,10) stimolano la deposizione di collagene I ed elastina⁴⁷. In lavori precedenti, abbiamo dimostrato che lo stress da taglio è un determinante importante per il reclutamento di monociti negli scaffold elettrofili 3D^48,49e che sia lo stress di taglio che l’allungamento ciclico influenzano la segnalazione paracrina tra monociti umani e cellule stromali mesenchimali⁵⁰. Fahy et al. hanno dimostrato che il flusso di taglio ha aumentato la secrezione di citochine pro-infiammatorie da parte di monociti umani⁵¹.

Nel loro insieme, le prove di cui sopra mostrano che un’adeguata comprensione e controllo dei carichi emodinamici è cruciale per il TE cardiovascolare e che è importante considerare la risposta infiammatoria per raggiungere questo obiettivo. Numerosi bioreattori sono stati descritti in precedenza per la coltura in vitro^{52,53,54,55,56,57,58} o ex vivo^59,60,61 di tessuti cardiovascolari. Tuttavia, tutti questi sistemi sono progettati per imitare il più possibile le condizioni di carico emodinamico fisiologico. Mentre questo è molto prezioso allo scopo di creare tessuti cardiovascolari in vitro o mantenere colture ex vivo, tali sistemi non consentono studi sistematici sugli effetti individuali dei singoli segnali. Questo perché l’applicazione sia dello stretching ciclico che dello stress di taglio in questi bioreattori è guidata dallo stesso flusso pressurizzato, che li collega intrinsecamente. Mentre i microsistemi che consentono un’accurata manipolazione meccanica multi-cue sono stati descritti per substrati^{2D 62} o configurazioni idrogel 3D^63,64, tali configurazioni non consentono l’incorporazione di scaffold di biomateriali 3D elastomerici.

Qui presentiamo l’applicazione di un sistema di bioreattore tubolare che consente in modo univoco il disaccoppiamento dello stress di taglio e dell’allungamento ciclico e aiuta a studiare meccanicamente i loro effetti individuali e combinati. Questo sistema consente di testare un’ampia varietà di innesti vascolari di ingegneria tissutale (ad esempio, origine sintetica o naturale, diverse micro-architetture, varie porosità). Per disaccoppiare efficacemente l’applicazione dello sforzo di taglio e dell’allungamento, i concetti chiave utilizzati dal bioreattore sono (1) separazione del controllo dello sforzo di taglio e dello stiramento utilizzando sistemi di pompaggio distinti e (2) stimolazione degli scaffold in modo “inside-out” con dimensioni guidate computazionalmente. Il flusso viene applicato sulla superficie esterna dell’impalcatura tubolare attraverso l’uso di una pompa di flusso, mentre l’allungamento circonferenziale dell’impalcatura è indotto dall’espansione di un tubo di silicone su cui è montato l’impalcatura attraverso l’uso di una pompa di deformazione separata. Le dimensioni del tubo di silicone e del tubo di vetro che contiene il costrutto sono accuratamente scelte e convalidate utilizzando simulazioni fluidodinamiche computazionali, per garantire che lo sforzo di taglio sull’impalcatura (dovuto al flusso) e l’allungamento circonferenziale (dovuto all’espansione del tubo) non si influenzino in modo significativo l’un l’altro. Questo design inside-out ha diverse motivazioni pratiche. Se l’allungamento viene applicato dalla pressione del fluido luminale (simile al carico fisiologico), richiede intrinsecamente che il design del campione sia privo di perdite. Inoltre, la pressione necessaria per allungare il campione sarebbe completamente determinata dalla rigidità del campione, che può variare tra i campioni e all’interno di un campione nel tempo, rendendo difficile il controllo dell’allungamento. Questo bioreattore monta l’innesto di ingegneria tissutale attorno a un tubo di silicone e consente l’applicazione dello stress di taglio della parete (WSS) sulla parete esterna dell’innesto e pressurizza l’innesto dall’interno. In questo modo, è possibile garantire condizioni di carico uguali tra i campioni e all’interno dei campioni nel tempo e, inoltre, i campioni possono essere permeabili, come è comune per gli scaffold vascolari porosi¹⁹. Questo bioreattore inside-out è specificamente destinato a studi sistematici sugli effetti del taglio e / o dell’allungamento, piuttosto che all’ingegneria di un vaso sanguigno nativo in vitro, per il quale le tradizionali configurazioni del bioreattore vascolare sono più adatte. Vedere la Figura 1A–B per i disegni di progettazione del bioreattore e la corrispondente Tabella 1 per una descrizione funzionale e una logica alla base dei componenti principali del bioreattore.

L’uso del bioreattore è dimostrato sulla base di una serie di recenti studi del nostro gruppo in cui abbiamo studiato le influenze individuali e combinate dello stress da taglio e dell’allungamento ciclico sull’infiammazione e sulla formazione dei tessuti in scaffold elettrofilari riassorbibili per tessuto cardiovascolare in situ^19,43,44. A tal fine, abbiamo utilizzato macrofagi e miofibroblasti umani in mono- o in co-coltura per simulare le varie fasi della cascata rigenerativa in situ. Abbiamo dimostrato che la secrezione di citochine da parte dei macrofagi umani è distintamente influenzata sia dallo stretching ciclico che dallo stress di taglio, influenzando la deposizione e l’organizzazione della matrice da parte dei miofibroblasti umani in questi scaffold, sia tramite segnalazione paracrina che contatto diretto^19,43,44. In particolare, questi studi hanno rivelato che nel caso di applicazione combinata di sforzo di taglio e stretching, gli effetti sulla formazione e l’infiammazione dei tessuti sono dominati da uno dei due carichi, oppure ci sono effetti sinergici di entrambi i carichi. Questi risultati illustrano l’importanza del disaccoppiamento di entrambi i carichi per ottenere una migliore comprensione del contributo dell’ambiente meccanico sui processi TE. Questa comprensione può essere applicata per ottimizzare sistematicamente i parametri di progettazione dell’impalcatura nei regimi di carico emodinamico pertinenti. Inoltre, i dati meccanicistici provenienti da tali ambienti ben controllati possono servire come input per i modelli numerici che sono in fase di sviluppo per prevedere il decorso del rimodellamento tissutale in situ, come recentemente riportato per i TEVG⁶⁵ o TEHV⁶⁶, per migliorare ulteriormente la capacità predittiva.