Espectroscopía de correlación de fluorescencia de variación puntual para el análisis de difusión molecular en la membrana plasmática de células vivas

1. Especificación de configuración para ensamblar una configuración svFCS personalizada NOTA: La simplicidad de la configuración propuesta de svFCS permite una fácil instalación, operación y mantenimiento a un bajo costo, al tiempo que garantiza la eficiencia en la recuperación de fotones. Para obtener más información, consulte Material complementario. Sala experimental y seguridad Instale el sistema en una habitación estabilizada a unos 21 °C. Evite el flujo de aire directo en la mesa óptica pasiva (o activa) y siga las reglas de seguridad láser para la alineación óptica. Hardware y softwareNOTA: El material complementario detalla los pasos de instalación representados en la Figura 2. Escriba el software principal de adquisición y control en LabVIEW utilizando una arquitectura de estructura de eventos y máquinas de estado donde una placa de adquisición multifunción impulsa la mayoría de los controladores.NOTA: El correlacionador, el láser y el medidor de potencia son controlados o monitoreados por su propio software. Adaptar los procedimientos de instalación de hardware y software según el hardware utilizado. Configuración ópticaNOTA: La Figura 3 ilustra los módulos de banco óptico utilizados en las siguientes secciones para controlar la calidad de las alineaciones ópticas. Todas las especificaciones de los elementos ópticos se enumeran en la Tabla de materiales. El procedimiento para construir la configuración está ampliamente detallado en Material complementario. Este sistema comprende un láser de onda continua, un microscopio invertido motorizado equipado con un objetivo de agua de inmersión, un detector de fotodiodos de avalancha acoplado a un solo módulo de conteo de fotones y un correlacionador de hardware. Una cámara de incubación de microscopio con calentadores libres de vibraciones ha sido especialmente diseñada para controlar la temperatura para experimentos en células vivas. Por convención, el eje XY corresponde al plano perpendicular de la ruta óptica, y el eje Z corresponde a la ruta óptica. 2. Punto de control diario antes de ejecutar el experimento Controlar la trayectoria de excitación (Figura 3, & ). Abra todos los diafragmas del iris. Mida la potencia del láser con el medidor de potencia, manteniendo el primer iris completamente abierto. Gire la placa de media onda (HWP) para encontrar la potencia máxima. Compruebe la alineación utilizando el iris si la potencia del láser es inferior a la habitual, y mueva L1 y M1 alternativamente, si es necesario. Anote el valor de potencia en el cuaderno de laboratorio del experimento. Controlar la ruta de detección (Figura 3, & ). Coloque el agua, un cubrehojas y una gota de una solución de rodamina 6G (Rh6G) de 2 nM en el objetivo. Si la señal de fluorescencia (número de conteo en el APD, grabado con el software LabVIEW) es más baja de lo habitual, rehaga la solución Rh6G, verifique el posicionamiento y el número de la cubierta en la lente del objetivo, o elimine las burbujas, si las hay. Si la señal de fluorescencia sigue siendo más baja de lo habitual, coloque el medidor de potencia dentro de la trayectoria óptica para bloquear el haz. Apague el APD (en adelante, APD se refiere al APD y al módulo de conteo de fotones únicos). Retire la muestra. Limpie y reemplace la lente del objetivo con un objetivo reflectante. Compruebe el rayo láser en el objetivo reflectante retirando el medidor de potencia de la trayectoria de la luz. Asegúrese de que el haz del objetivo esté centrado y que el reflejo posterior alcance el primer iris de la línea (Figura 3). De lo contrario, ajuste la posición central con M2 o el reflejo posterior con el espejo dicroico. Si el acoplamiento del microscopio es correcto, empuje la lente del objetivo hacia atrás, agregue una gota de agua, un cobertor y una gota de una solución Rh6G más concentrada (es decir, 200 nM) y establezca una potencia láser más baja que para las mediciones clásicas (pocos μW). Encienda el APD y optimice la alineación APD y estenopeica, alternativamente, con sus respectivos tornillos de ajuste XYZ mientras monitorea la señal de intensidad (software LabVIEW). Cambie el deslizamiento de la cubierta y agregue una menor concentración de Rh6G (2 nM). Mueva el agujero de alfiler a lo largo del eje Z para encontrar una posición en la que la relación de brillo molecular aumente y la cintura sea mínima. Cierre el iris hasta que la señal disminuya: el tamaño del rayo láser alcanza el tamaño de apertura posterior del objetivo (es decir, el tamaño mínimo de la cintura, consulte Material suplementario). Inicie el software del correlacionador y registre los datos (consulte la sección 7 para el registro de datos). Compruebe el ACF, que debe mostrar una baja cantidad de ruido, dar un tamaño de cintura pequeño y una alta tasa de recuento por molécula por segundo (ver sección 7 para el análisis de datos y la evaluación del tamaño de la cintura). 3. Consideraciones generales para el registro y análisis de datos svFCS Registre y analice los datos de fluorescencia siguiendo este esquema general (consulte las secciones 7, 8 y 9): (1) registro de fluorescencia y generación de ACF (software de correlación), (2) descarte inesperado de datos, un promedio de datos retenidos, que se ajuste al modelo apropiado (con software Igor Pro casero), (3) diagrama de ley de difusión (software matlab casero 1) y (4) comparación de ley de difusión opcional (software MATLAB casero 2). Los diferentes programas de software están disponibles bajo petición.NOTA: El correlacionador de hardware tiene un tiempo de muestreo mínimo de 12,5 ns (es decir, una frecuencia de muestreo de 80 MHz). Proporciona una resolución temporal que es al menos 1.000 más baja que el tiempo residente típico de difusión libre de moléculas pequeñas en solución y 106 más pequeña que el tiempo de difusión de proteínas de membrana dentro de un volumen de observación confocal. 4. Cultivo celular y transfección Sembra las células Cos7 en un vidrio de cubierta con cámara de 8 pocillos con fondo de vidrio de borosilicato # 1.0 a una densidad de 10,000 células / pozo utilizando el Medio Eagle Modificado (DMEM) completo de Dulbecco complementado con suero bovino fetal al 5%, penicilina (100 U / mL), estreptomicina (100 U / mL) y L-glutamina (1 mM). Cultive las células a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenga 5% de CO2 durante 24 h. Retire el medio, agregue 300 μL del medio de cultivo completo fresco por pocillo y preincuba las células durante 30 min a 37 °C. Diluir 0,5 μg del ADN plásmido que codifica la proteína Thy-1 fusionada con eGFP25 en 50 μL de DMEM sin suero. Vórtice brevemente para mezclar. Diluya 1,5 μL del reactivo de transfección de ADN en 50 μL de DMEM sin suero y mezcle bien la solución. Agregue el reactivo de transfección diluido directamente en la solución de ADN preparada y mezcle los compuestos inmediatamente. Incubar la mezcla preparada durante 10 a 15 min a temperatura ambiente. Agregue 10 μL de los complejos combinados de ADN / reactivo de transfección en forma gota a gota en el medio en cada pozo, y homogeneice girando suavemente la placa. Incubar las células a 37 °C con 5% de CO2 durante 3 h. Después de la incubación, reemplace el medio que contiene complejos de REACTIVO DE ADN / transfección con 400 μL de DMEM completo fresco y cultive las células durante 16 h antes del experimento svFCS. 5. Preparación de células para mediciones de svFCS Elimine el medio de cultivo. Lave las células suavemente dos o tres veces con el tampón de solución salina equilibrada (HBSS) de Hank sin suero que contiene Ca2+ y Mg2+ suplementado con 10 mM (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatenosulfónico) (HEPES), pH 7.4 (HBSS/HEPES). Mantenga las celdas en el búfer HBSS/HEPES durante todas las adquisiciones de svFCS. 6. Tratamiento farmacológico Retire el medio de cultivo y lave las células dos o tres veces con HBSS sin suero suplementado con 10 mM HEPES, pH 7.4 (HBSS/HEPES). Incubar las células con 1 U/ml de solución de colesterol oxidasa (COase) en tampón HBSS/HEPES durante 1 h a 37 °C. Retire la solución y mantenga las células en presencia de 0,1 U/ml de COase en el búfer HBSS/HEPES mientras realiza las mediciones de svFCS. 7. Calibración del tamaño del punto Precalentar la cámara del microscopio a 37 °C. Preparar una solución estándar de 2 nM de Rh6G por dilución en serie. Deje caer 200 μL de solución 2 nM Rh6G sobre una cubierta de vidrio colocada en el objetivo de inmersión en agua. Inicie todo el hardware y software. Mida y ajuste la potencia del rayo láser de 488 nm a 300 μW. Dependiendo del brillo y la fotoestabilidad de la sonda fluorescente utilizada, adapte esta potencia de acuerdo con (1) la intensidad de fluorescencia (en el software LabVIEW), que debe ser estable, (2) la forma ACF (en el software del correlacionador), que debe tener una forma constante a lo largo del tiempo, y (3) los parámetros de ajuste que dan un tamaño de cintura pequeño y una alta tasa de recuento por molécula (fotones por molécula por segundo, típicamente de pocas decenas a cientos de fotones por molécula por segundo).NOTA: La amplitud del ACF (llamado G(0)) es inversamente proporcional al número de la molécula (es decir, la concentración de la sonda fluorescente). Para la calibración del tamaño de la cintura, este es un buen parámetro candidato de control de calidad. Por lo tanto, G(0) debe ser similar para la misma concentración de un día a otro, ya que vincula el tamaño de la cintura y la concentración. Para las mediciones celulares, como FCS es más preciso para baja concentración, G(0) debe ser alto para la extracción adecuada del ajuste de parámetros. Configure el puerto del microscopio de iluminación/detección svFCS con el software LabVIEW. Encienda el APD. Cierre el iris hasta que la señal baje para obtener el tamaño mínimo de la cintura, o ciérrelo para un tamaño de cintura más grande. Registre varios ACF de duración seleccionada (es decir, una ejecución) para mejorar la reproducibilidad estadística, generalmente 10 ejecuciones que duran 20 s cada una con el software del correlacionador. Apague el APD. Utilice el software Igor Pro para comprobar y descartar las tiradas con fuertes fluctuaciones debidas a agregados moleculares. Realice este paso manualmente: debe ser independiente del usuario después de que los usuarios hayan sido entrenados. Ajuste el promedio de los ACF retenidos con un modelo de difusión 3D. Extraiga de los parámetros de ajuste el tiempo de difusión promedio y guárdelo en un archivo “.txt” (el formato de archivo es dictado por el software Igor Pro). Verifique la tasa de recuento por molécula por segundo (un buen indicador de rendimiento) dividiendo la intensidad promedio (extraída de la traza de fluorescencia) por el número de moléculas (extraídas del ACF).NOTA: Asegúrese de que este valor es alto y estable día a día para los mismos parámetros de adquisición. Conociendo el coeficiente de difusión de Rh6G en solución acuosa a 37 °C (D) y (ver 7.13), calcule el tamaño experimental de la cintura ω de acuerdo con: . Aplicar el procedimiento para cada modificación del tamaño de la cintura requerida para trazar la ley de difusión FCS y antes de cualquier nueva serie experimental de adquisición de datos svFCS. 8. Adquisiciones de datos svFCS en células Mida y ajuste la potencia del haz de 488 nm entre 2 y 4 μW. Dependiendo del brillo y la fotoestabilidad de la sonda fluorescente utilizada, adapte esta potencia para permitir una alta tasa de recuento por molécula (generalmente varios miles de fotones por molécula por segundo), manteniendo el fotoblanqueo bajo (es decir, un rastro de intensidad estable en el software LabVIEW). Equilibre las muestras durante 10 min a 37 °C antes de comenzar las mediciones. Ajuste el microscopio de iluminación de epifluorescencia con el software LabVIEW. Elija una celda con una ubicación de sonda fluorescente adecuada y una intensidad de señal de fluorescencia (baja).NOTA: Cuanto menor sea la fluorescencia, mejores serán las mediciones de FCS (consulte el paso 8.1). Configure el puerto del microscopio de iluminación/detección svFCS con el software LabVIEW. Encienda el APD. Realice un xy-scan de la celda seleccionada con el software LabVIEW. Realice un escaneo z y ubique el punto confocal en la intensidad máxima de fluorescencia eligiendo la membrana plasmática en la parte superior e inicie la adquisición de datos. Para maximizar la separación entre las dos membranas, preferiblemente realice el escaneo en el área nuclear de la célula. Grabe una serie de 20 ejecuciones que duren 5 s, cada una con el software del correlacionador.NOTA: Asegúrese de que la duración de cada ejecución sea lo suficientemente larga como para obtener ACF con ruido reducido. Las adquisiciones largas son susceptibles al fotoblanqueo o a variaciones sustanciales inesperadas (por ejemplo, agregados). Adapte el número de tiradas, su duración y el número de series a las muestras, pero asegúrese de que permanezcan constantes dentro de la misma masa de experimentos para su reproducibilidad. Apague el APD. Descarte las ejecuciones inesperadas con el software Igor Pro. Ajuste el ACF promedio con un modelo de difusión 2D de 2 especies. Adaptar este modelo al tipo de comportamiento de difusión de la molécula diana. Guarde los parámetros de conexión en el archivo anterior (consulte el paso 7.13). Realice de 10 a 15 series de grabaciones en al menos 10 celdas diferentes y reproduzca los pasos 8.3 a 8.13. Compruebe que el único archivo obtenido contiene la información sobre el tamaño de la cintura y los parámetros de ajuste de las 10 a 15 grabaciones. Para establecer una sola ley de difusión, analice al menos cuatro tamaños de cintura que varían entre 200 y 400 nm. Este rango está definido por el límite óptico de difracción, pero depende del objetivo (apertura numérica) y del láser (longitud de onda).NOTA: Como la calibración del tamaño de la cintura no es absoluta y tiene cierto grado de incertidumbre, se creó un software MATLAB28 dedicado que tiene en cuenta el error x e y (es decir, ω2 y td) para ajustarse a la ley de difusión. Inicie el software MATLAB 1 y seleccione una carpeta que contenga todos los archivos “.txt” correspondientes a al menos cuatro experimentos de tamaño de cintura. La trama <td> versus <ω2>, es decir, la ley de difusión. Se pueden extraer dos parámetros principales: la intersección del eje y (t0) y el coeficiente de difusión efectivo (Deff, inversamente proporcional a la pendiente). 9. Leyes de difusión de diferentes condiciones experimentales de comparación NOTA: Si es necesario, reproduzca las secciones 7 y 8 para diferentes condiciones experimentales. Se desarrolló un software dedicado (software MATLAB 2) para determinar si estas leyes de difusión son similares o no de acuerdo con los valores t0 y Deff 28. Prueba dos hipótesis: los dos valores son diferentes, o los dos valores no son diferentes en un umbral establecido por encima de una probabilidad de falsa alarma (PFA). Un valor arbitrario de PFA del 5% (T = 3,8) se considera el límite superior de significación entre dos parámetros (t0 o Deff), lo que indica que solo hay un 5% de posibilidades de que los dos valores sean idénticos. Cree un archivo “.xls” que contenga los valores característicos de la ley de difusión de cada condición para comparar (es decir, un archivo que contenga el error t0, t0 , Deff y Deff para las condiciones no tratadas (NT) y tratadas (COase) como una tabla). Inicie el software MATLAB 2. Seleccione el archivo “.xls”. Analice la gráfica 2D codificada por colores generada, donde las pruebas estadísticas t0 y Deff se graficarán en los ejes x e y, respectivamente (Figura 4). Cuanto mayor es T, mayor es la diferencia entre los valores comparados. 10. Mediciones de la concentración de colesterol Tratamiento celular y lisis Sembrar las células de Cos7 por triplicado en placas de 6 pocillos a 4 × 105 células/pozo e incubar en 2 mL de DMEM completo a 37 °C con 5% de CO2 durante la noche para permitir que las células se adhieran a la placa. Retire el medio de cultivo y lave las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 1 ml de tampón HBSS/HEPES que contenga (o no, para los controles) 1 U/ml de coase, e incubar durante 1 h a 37 °C con un 5% de CO2. Sustituir el medio por 1 ml de HBSS/HEPES que contenga 0,1 U/ml de coase, e incubar durante 1 h a 37 °C con 5% de CO2. Retire la solución y recolecte las células. Lave las células tres veces con PBS y centrífuga a 400 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Lisar las células con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (25 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM, MgCl2, 1 mM de ácido tetraacético etilendiamina, 2% de glicerol, proteasa y cóctel inhibidor de la fosfatasa) durante 30 min en hielo. Centrifugar los lisados a 10000 × g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Cuantificar la concentración total de proteínas para cada muestra mediante el ensayo de proteínas de Bradford modificado utilizando la solución de trabajo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Medición de la concentración de colesterol Para determinar el nivel de colesterol celular total enzimáticamente, use el kit apropiado (por ejemplo, Amplex Red Cholesterol Assay Kit) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para cada reacción, mezcle la muestra que contiene 5 μg de proteína con la solución de trabajo Amplex Red reactivo/peroxidasa de rábano picante/colesterol oxidasa/colesterol esterasa, e incube durante 30 min a 37 °C en la oscuridad. Mida la fluorescencia utilizando una excitación de 520 nm y detecte la emisión a 560-590 nm utilizando un lector de microplacas. Reste el fondo del valor final y determine la concentración de colesterol utilizando una curva estándar. Calcular el contenido final de colesterol en ng de colesterol por μg de proteína.