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Biochemistry

Espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot para análise de difusão molecular na membrana plasmática de células vivas

Published: November 12, 2020
doi:
10.3791/61823
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1CNRS, Inserm, Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Univ, 2Faculty of Biotechnology,University of Wroclaw, 3Faculty of Biological Sciences,University of Wroclaw, 4CNRS, Centrale Marseille, Institut Fresnel,Aix Marseille Univ

Summary

Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo sobre como construir um microscópio de espectroscopia de correlação de fluorescência (svFCS) para medir a difusão molecular na membrana plasmática das células vivas.

Abstract

Processos biológicos dinâmicos em células vivas, incluindo aqueles associados à organização da membrana plasmática, ocorrem em várias escalas espaciais e temporais, variando de nanômetros a micrômetros e microssegundos a minutos, respectivamente. Uma gama tão ampla de processos biológicos desafia abordagens convencionais de microscopia. Aqui, detalhamos o procedimento para implementar as medidas de espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot (svFCS) usando um microscópio clássico de fluorescência que foi personalizado. O protocolo inclui uma verificação de desempenho específica da configuração svFCS e as diretrizes para medições de difusão molecular por svFCS na membrana plasmática das células vivas em condições fisiológicas. Além disso, fornecemos um procedimento para interromper nanodomínios de balsa de membrana plasmática por tratamento oxidase de colesterol e demonstramos como essas mudanças na organização lateral da membrana plasmática podem ser reveladas pela análise svFCS. Em conclusão, este método baseado em fluorescência pode fornecer detalhes sem precedentes sobre a organização lateral da membrana plasmática com a resolução espacial e temporal apropriada.

Introduction

A complexidade da organização da membrana plasmática
A compreensão atual da organização da membrana celular tem que levar em conta vários aspectos1. Primeiro, uma composição lipídica complexa varia não apenas entre os tipos celulares, mas também dentro de uma única célula (organelas de membrana/membrana plasmática). Além disso, as proteínas de membrana associada ou intrínseca são principalmente organizadas em complexos multimédicos dinâmicos, com grandes domínios se estendendo fora da membrana, representando uma área significativamente maior do que a dos domínios transmembranos sozinhos. Além disso, as proteínas associadas à membrana apresentam capacidades específicas de ligação lipídica ou interação lipídica que desempenham papéis na regulação da função proteica. Estes dependem diretamente da composição local e acessibilidade dos lipídios2.

Finalmente, observa-se um nível significativo de assimetria entre dois folhetos de membrana devido à estrutura assimétrica intrínseca das proteínas da membrana e à distribuição de lipídios. De fato, um equilíbrio metabólico lipídico entre síntese e hidrólise, combinado com flip-flop lipídico entre os folhetos, gera tal distribuição assimétrica. Como qualquer transporte através do bicamado é limitado pela energia livre necessária para mover o grupo polar através do interior hidrofóbico das membranas, geralmente é assistido por transportadores seletivos. Para cada tipo de célula, a assimetria tende a ser mantida firmemente. Ao todo, esses fatores contribuem para a inhomogeneidade lateral ou compartimentação da membranaplasmática 3,4.

Enriquecemos essa representação da membrana plasmática levando em conta a difusão molecular intrínseca dentro e em toda a bicamada, o que contribui para a heterogeneidade lateral dinâmica em uma escala de décimos a centenas de nanômetros e microssegundos a segundos. Por exemplo, nanodomínios de membrana dependentes de lipídios — as chamadas balsas lipídicas, definidas como colesterol e plataformas de sinalização ricas em sphingolipid — contribuem para a compartimentação da membrana plasmática 5,6. No entanto, a visão atual da organização da membrana não se restringe apenas a jangadas lipídicas. Nanodomínios de membrana são mais complexos e heterogêneos na composição, origem e função. Ainda assim, sua presença na membrana plasmática deve ser fortemente coordenada, e interações dinâmicas entre proteínas e lipídios parecem ser importantes na distribuição espacial e modificação química dos nanodomínios de membrana 1,3,7,8.

O princípio svFCS e sua aplicação para sondar a organização da membrana plasmática
Embora muito progresso tenha sido feito na análise dos domínios da membrana, principalmente através de técnicas biofísicas, os determinantes que ditam a organização local da membrana plasmática precisam ser refinados com resolução espacial e temporal adequada. Determinantes baseados no rastreamento de moléculas individuais fornecem excelente precisão espacial e permitem a caracterização de diferentes modos de movimento 9,10,11,12, mas têm uma resolução temporal limitada com taxas clássicas de quadros de câmera baixa e requerem mais esforço experimental para registrar um número significativo de trajetórias. Alternativamente, o coeficiente de difusão dos componentes da membrana pode ser avaliado pela recuperação da fluorescência após o fotobleaching (FRAP)13 ou espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS)14. Este último tem recebido mais atenção, principalmente por sua alta sensibilidade e seletividade, volume de detecção microscópica, baixa invasividade e ampla gama dinâmica15.

A base conceitual da FCS foi introduzida por Magde e colegas há cerca de 50 anos, 16,17. Baseia-se no registro da flutuação da emissão de fluorescência com alta resolução temporal (de μs a s)18. Em sua versão moderna, as medições em células vivas são realizadas por um pequeno volume de excitação confocal (~0,3 femtoliters) posicionado dentro de uma região de interesse (por exemplo, na membrana plasmática); o sinal de fluorescência gerado pela difusão de moléculas fluorescentes que entra e sai do volume de observação é coletado com resolução temporal muito alta (ou seja, o tempo de chegada de cada fóton no detector). Em seguida, o sinal é computado para gerar a função de autocorrelação (ACF), a partir da qual o tempo médio td (tempo de difusão) para o qual uma molécula permanece dentro do volume focal é extraído, juntamente com o número médio de partículas, (N), presente no volume de observação, que é inversamente proporcional à amplitude do ACF. Este último parâmetro pode ser uma informação útil sobre a concentração da molécula dentro do volume de observação.

Desde então, um número crescente de modalidades de FCS foram implementadas graças ao rápido desenvolvimento da instrumentação em biofotônica, permitindo a descrição de fenômenos dinâmicos que ocorrem em sistemas vivos. Ainda assim, uma espécie molecular experimentaria uma distribuição mais sobreposta dos valores do coeficiente de difusão, o que geralmente é refletido por uma característica de difusão anômica, na qual as moléculas se difundem com uma relação não linear no tempo19, e dificuldade em identificar o significado biológico dessa subdiffusão anômica. No passado, essa dificuldade foi um pouco superada ao registrar a difusão molecular por FRAP de áreas de vários tamanhos, em vez de apenas uma área, fornecendo assim informações espaciais adicionais. Isso possibilitou, por exemplo, a conceituação das microdomínios de membrana 20,21,22.

Uma tradução dessa estratégia para as medições de FCS (ou seja, a chamada espectroscopia de correlação de fluorescência de variação spot (svFCS)) foi estabelecida variando o tamanho do volume focal de observação, permitindo que a flutuação na fluorescência seja registrada em diferentes escalas espaciais23. Assim, a abordagem svFCS fornece informações espaciais indiretas que permitem a identificação e determinação de modos de difusão molecular e tipo de particionamento de membrana (domínios isolados versus contíguos24) de moléculas estudadas. Ao traçar o tempo de difusão td em função das várias escalas espaciais definidas pelo valor da cintura (ω), que corresponde ao tamanho do raio do feixe de detecção neste caso23,25, pode-se caracterizar a lei de difusão de uma determinada molécula em uma determinada condição fisiológica. O svFCS é, portanto, um analógico perfeito para rastreamento de partículas únicas no domínio de tempo26. Sob a restrição de difusão browniana, deve-se esperar uma relação estritamente linear entre o tempo de difusão td e a cintura ω (Figura 1)23,25. A origem do desvio da lei de difusão desse esquema pode ser atribuída a razões não exclusivas, como malha citoesqueleto, aglomeração molecular, particionamento dinâmico em nanodomínios, ou qualquer combinação desses e outros efeitos (Figura 1), e precisa ser testado experimentalmente25.

Aqui fornecemos todos os pontos de verificação necessários para o uso diário de um sistema óptico svFCS personalizado construído do zero, o que complementa nossas revisões de protocolo anteriores27,28 sobre essa abordagem experimental. Além disso, como prova de conceito, damos orientações sobre a calibração da configuração, a preparação de células, aquisição de dados e análise para o estabelecimento da lei de difusão svFCS (DL) para o Thy1-GFP, uma proteína ancorada em membrana plasmática glycosylphosphatidylinositol, que é conhecida por ser localizada em nanodomínios lipídicos-jantas29. Finalmente, demonstramos como a desestabilização parcial dos nanodomínios lipídes-jangadas pelo tratamento oxidase de colesterol impacta as propriedades de difusão do Thy1-GFP. Além disso, uma descrição detalhada da construção de uma configuração svFCS do zero é fornecida em material suplementar.

Protocol

1. Configuração de especificação para a montagem de uma configuração svFCS personalizada NOTA: A simplicidade da configuração svFCS proposta permite fácil instalação, operação e manutenção a um baixo custo, garantindo eficiência na recuperação de fótons. Para obter mais detalhes, consulte material complementar. Sala experimental e segurança Instale o sistema em uma sala estabilizada em torno de 21 °C. Evite o fluxo de ar direto na tabela óptica passiva (ou ativa) e siga as regras de segurança do laser para alinhamento óptico. Hardware e softwareNOTA: O material suplementar detalha as etapas de instalação retratadas na Figura 2. Escreva o principal software de aquisição e controle no LabVIEW usando uma arquitetura de estrutura de máquina e eventos de estado onde uma placa de aquisição multifuncional conduz a maioria dos controladores.NOTA: O correlator, o laser e o medidor de energia são controlados ou monitorados por seu próprio software. Adapte os procedimentos de instalação de hardware e software de acordo com o hardware utilizado. Configuração ópticaNOTA: A Figura 3 ilustra os módulos de bancada óptico utilizados nas seguintes seções para controlar a qualidade dos alinhamentos ópticos. Todas as especificações do elemento óptico estão listadas na Tabela de materiais. O procedimento para construir a configuração é amplamente detalhado em material suplementar. Este sistema compreende um laser de ondas contínuas, um microscópio invertido motorizado equipado com um objetivo de água de imersão, um detector de fotodiodos de avalanche acoplado a um único módulo de contagem de fótons, e um correlator de hardware. Uma câmara de incubação de microscópios com aquecedores livres de vibração foi especialmente projetada para controlar a temperatura para experimentos em células vivas. Por convenção, o eixo XY corresponde ao plano perpendicular do caminho óptico, e o eixo Z corresponde ao caminho óptico. 2. Ponto de verificação diário antes de executar o experimento Controle o caminho de excitação (Figura 3, & ). Abra todos os diafragmas de íris. Meça a potência laser com o medidor de energia, mantendo a primeira íris totalmente aberta. Gire a placa de meia onda (HWP) para encontrar a potência máxima. Verifique o alinhamento usando as íris se a potência do laser é menor do que o normal, e mova L1 e M1 alternadamente, se necessário. Observe o valor de energia no caderno de laboratório de experimentos. Controle o caminho de detecção (Figura 3, & ). Coloque a água, uma mancha de cobertura e uma gota de uma solução de rhodamina 6G (Rh6G) de 2 nM no objetivo. Se o sinal de fluorescência (número de contagem no APD, gravado com o software LabVIEW) for menor do que o habitual, refaça a solução Rh6G, verifique o posicionamento e o número do deslizamento na lente objetiva, ou elimine bolhas, se houver. Se o sinal de fluorescência ainda estiver mais baixo do que o normal, coloque o medidor de alimentação dentro do caminho óptico para bloquear o feixe. Desligue o APD (a partir de agora, o APD refere-se ao APD e ao módulo de contagem de fótons único). Remova a amostra. Limpe e substitua a lente objetiva por um alvo reflexivo. Verifique o raio laser no alvo reflexivo removendo o medidor de energia do caminho da luz. Certifique-se de que o feixe do alvo está centrado, e o reflexo traseiro atinge a primeira íris na linha (Figura 3). Se não, ajuste o posicionamento central com M2 ou o reflexo traseiro com o espelho dicroico. Se o acoplamento do microscópio estiver correto, empurre a lente objetiva para trás, adicione uma gota de água, um deslizamento de tampa e uma gota de uma solução Rh6G mais concentrada (ou seja, 200 nM), e defina uma potência laser menor do que para as medidas clássicas (poucas μW). Ligue o APD e otimize o alinhamento apd e pinhole, alternadamente, com seus respectivos parafusos de ajuste XYZ enquanto monitora o sinal de intensidade (software LabVIEW). Altere a tampa e adicione uma menor concentração de Rh6G (2 nM). Mova o orifício ao longo do eixo Z para encontrar uma posição onde a relação de brilho molecular aumenta, e a cintura é mínima. Feche a íris até que o sinal caia: o tamanho do raio laser atinge o tamanho da abertura traseira do objetivo (ou seja, o tamanho mínimo da cintura, ver material suplementar). Inicie o software correlator e grave dados (consulte a seção 7 para gravação de dados). Verifique o ACF, que deve apresentar uma baixa quantidade de ruído, dê um tamanho pequeno da cintura e uma alta taxa de contagem por molécula por segundo (ver seção 7 para análise de dados e avaliação do tamanho da cintura). 3. Considerações gerais para registro e análise de dados svFCS Registo e analise os dados de fluorescência seguindo este esquema geral (ver seções 7, 8, e 9): (1) registro de fluorescência e geração ACF (software correlator), (2) descarte inesperado de dados, uma média de dados retidos, adequação ao modelo apropriado (com software Caseiro Igor Pro), (3) parcela da lei de difusão (software MATLAB caseiro 1) e (4) comparação opcional da lei de difusão (software MATLAB caseiro 2). Os diferentes programas de software estão disponíveis mediante solicitação.NOTA: O correlator de hardware tem um tempo mínimo de amostragem de 12,5 ns (ou seja, uma frequência amostral de 80 MHz). Ele fornece uma resolução temporal que é pelo menos 1.000 menor do que o tempo típico residente de difundir livremente pequenas moléculas em solução e 106 menor do que o tempo de difusão de proteínas de membrana dentro de um volume de observação confocal. 4. Cultura celular e transfecção Semente as células Cos7 em vidro de cobertura de 8 poços com fundo de vidro borossilicato #1,0 a uma densidade de 10.000 células/bem usando o médio de águia modificada (DMEM) completo de Dulbecco complementado com 5% de soro bovino fetal, penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 U/mL) e L-glutamina (1 mM). Cultura as células a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 por 24 h. Retire o meio, adicione 300 μL do meio de cultura completo fresco por poço e pré-insinuada as células por 30 minutos a 37 °C. Diluir 0,5 μg do DNA plasmídeo codificando a proteína Thy-1 fundida com eGFP25 em 50 μL de DMEM sem soro. Vórtice brevemente para misturar. Diluir 1,5 μL do reagente de transfecção de DNA em 50 μL de DMEM sem soro, e misturar bem a solução. Adicione o reagente de transfecção diluído diretamente na solução de DNA preparada e misture os compostos imediatamente. Incubar a mistura preparada por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Adicione 10 μL do reagente combinado de DNA/transfecção se encaixa no meio em cada poço, e homogeneize girando suavemente a placa. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2 por 3 h. Após a incubação, substitua o meio contendo complexos de reagente de DNA/transfecção por 400 μL de DMEM completo fresco, e cultue as células por 16 h antes do experimento svFCS. 5. Preparação de células para medições de svFCS Remova o meio de cultura. Lave as células suavemente duas a três vezes com o tampão de sal balanceado da Solução de Sal (HBSS) da Hank sem soro contendo ca2+ e Mg2+ complementado com 10 mM (4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanesulfonic acid) (HEPES), pH 7.4 (HBSS/HEPES). Mantenha as células no buffer HBSS/HEPES durante todas as aquisições do SVFCS. 6. Tratamento farmacológico Remova o meio de cultura e lave as células duas a três vezes com HBSS sem soro suplementado com HEPES de 10 mM, pH 7.4 (HBSS/HEPES). Incubar as células com 1 U/mL de solução de oxidase de colesterol (COase) no tampão HBSS/HEPES por 1 h a 37 °C. Remova a solução e mantenha as células na presença de 0,1 U/mL de COase no buffer HBSS/HEPES durante a realização das medições svFCS. 7. Calibração do tamanho da mancha Pré-aquecimento da câmara de microscópio a 37 °C. Prepare uma solução padrão de 2 nM de Rh6G por diluição serial. Solte 200 μL de solução 2 nM Rh6G em um deslizamento de tampa de vidro colocado no objetivo de imersão de água. Inicie todo o hardware e software. Meça e ajuste a potência do raio laser de 488 nm a 300 μW. Dependendo do brilho e da foto-estabilidade da sonda fluorescente utilizada, adapte essa potência de acordo com (1) a intensidade da fluorescência (no software LabVIEW), que deve ser estável, (2) a forma ACF (no software correlator), que deve ter uma forma constante ao longo do tempo, e (3) os parâmetros de montagem que dão um tamanho de cintura pequena e uma alta taxa de contagem por molécula (fótons por molécula por segundo, tipicamente poucas dezenas a centenas de fótons por molécula por segundo).NOTA: A amplitude do ACF (chamado G(0)) é inversamente proporcional ao número da molécula (ou seja, a concentração da sonda fluorescente). Para a calibração do tamanho da cintura, este é um bom parâmetro candidato de controle de qualidade. Portanto, G(0) deve ser semelhante para a mesma concentração do dia a dia, pois liga o tamanho e a concentração da cintura. Para as medições celulares, como a FCS é mais precisa para baixa concentração, G(0) deve ser alta para a extração adequada do encaixe do parâmetro. Defina a porta de microscópio de iluminação/detecção svFCS com o software LabVIEW. Ligue a polícia. Feche a íris até que o sinal caia para obter o tamanho mínimo da cintura, ou feche-a para maior tamanho da cintura. Registos de duração selecionada (ou seja, uma execução) para melhorar a reprodutibilidade estatística, normalmente 10 corridas com duração de 20 s cada com o software correlator. Desligue o APD. Use o software Igor Pro para verificar e descartar as corridas com fortes flutuações devido a agregados moleculares. Execute esta etapa manualmente, ela deve ser independente do usuário depois que os usuários forem treinados. Encaixe a média dos ACFs retidos com um modelo de difusão 3D. Extrair dos parâmetros de montagem o tempo médio de difusão e salvá-lo em um arquivo “.txt” (o formato do arquivo é ditado pelo software Igor Pro). Verifique a taxa de contagem por molécula por segundo (um bom indicador de desempenho) dividindo a intensidade média (extraída do traço de fluorescência) pelo número de moléculas (extraídas do ACF).NOTA: Certifique-se de que este valor é alto e estável no dia a dia para os mesmos parâmetros de aquisição. Conhecendo o coeficiente de difusão do Rh6G em solução aquosa a 37 °C (D) e (ver 7,13), calcule o tamanho experimental da cintura ω de acordo com: . Aplique o procedimento para cada modificação de tamanho da cintura necessária para traçar a lei de difusão fcs e antes de qualquer nova série experimental de aquisição de dados svFCS. 8. aquisição de dados svFCS em células Meça e ajuste a potência do feixe de 488 nm entre 2 e 4 μW. Dependendo do brilho e da fotoestabilidade da sonda fluorescente usada, adapte essa potência para permitir uma alta taxa de contagem por molécula (tipicamente vários milhares de fótons por molécula por segundo), mantendo o fotobleaching baixo (ou seja, um traço de intensidade estável no software LabVIEW). Equilibre amostras por 10 min a 37 °C antes de iniciar as medições. Defina o microscópio de iluminação de epi-fluorescência com o software LabVIEW. Escolha uma célula com localização de sonda fluorescente apropriada e intensidade de sinal de fluorescência (baixa).NOTA: Quanto menor for a fluorescência, melhores são as medidas de FCS (ver passo 8.1). Defina a porta de microscópio de iluminação/detecção svFCS com o software LabVIEW. Ligue a polícia. Realize uma varredura xy da célula selecionada com o software LabVIEW. Realize um z-scan e localize o ponto confocal na intensidade máxima de fluorescência escolhendo a membrana plasmática na parte superior e inicie a aquisição de dados. Para maximizar a separação entre as duas membranas, realize preferencialmente o exame na área nuclear da célula. Registo uma série de 20 corridas com duração de 5 s, cada uma com o software correlator.NOTA: Certifique-se de que a duração de cada execução é longa o suficiente para obter ACFs com ruído reduzido. Aquisições longas são suscetíveis a fotobleaching ou variações substanciais inesperadas (por exemplo, agregados). Adapte o número de corridas, sua duração e o número de séries às amostras, mas certifique-se de que elas permaneçam constantes dentro da mesma massa de experimentos para reprodutibilidade. Desligue o APD. Descarte corridas inesperadas com o software Igor Pro. Encaixe o ACF médio com um modelo de difusão 2D de 2 espécies. Adapte este modelo ao tipo de comportamento de difusão da molécula alvo. Salve os parâmetros de montagem no arquivo anterior (ver etapa 7.13). Realize de 10 a 15 gravações em pelo menos 10 células diferentes e reproduza os passos 8.3 a 8.13. Verifique se o único arquivo obtido contém as informações do tamanho da cintura e os parâmetros de montagem das gravações de 10 a 15. Para estabelecer uma lei única de difusão, analise pelo menos quatro tamanhos de cintura variando entre 200 e 400 nm. Esta faixa é definida pelo limite óptico de difração, mas é objetiva- (abertura numérica) e laser (comprimento de onda)-dependente.NOTA: Como a calibração do tamanho da cintura não é absoluta e tem algum grau de incerteza, um software MATLABdedicado 28 contabilizando o erro x e y (ou seja, ω2 e td) foi construído para se adequar à lei de difusão. Inicie o software MATLAB 1 e selecione uma pasta contendo todos os arquivos “.txt” correspondentes a pelo menos experimentos de tamanho de quatro cinturas. Enredo <td> versus <ω2>, ou seja, a lei de difusão. Dois parâmetros principais podem ser extraídos: a interceptação do eixo y (t0) e o coeficiente de difusão eficaz (Deff, inversamente proporcional à inclinação). 9. Leis de difusão de diferentes condições experimentais comparativo NOTA: Se necessário, reproduza as seções 7 e 8 para diferentes condições experimentais. Um software dedicado (software MATLAB 2) foi desenvolvido para determinar se essas leis de difusão são semelhantes ou não de acordo com os valores t0 e Deff 28. Ele testa duas hipóteses: os dois valores são diferentes, ou os dois valores não são diferentes em um limiar definido acima de uma probabilidade de alarme falso (PFA). Um valor pfa arbitrário de 5% (T = 3,8) é considerado o limite superior de significância entre dois parâmetros (t0 ou Deff), indicando que há apenas 5% de chance de que os dois valores sejam idênticos. Crie um arquivo “.xls” contendo os valores característicos da lei de difusão de cada condição para comparar (ou seja, um arquivo contendo o erro t0, t0, Deff e D para as condições não tratadas (NT) e tratadas (COase) como tabela). Inicie o software MATLAB 2. Selecione o arquivo “.xls”. Analise o gráfico 2D codificado por cores gerados, onde os testes estatísticos t0 e Ddevem ser plotados nos eixos x e y, respectivamente (Figura 4). Quanto maior o T, maior é a diferença entre os valores comparados. 10. Medidas de concentração de colesterol Tratamento celular e lise Semente as células Cos7 em triplicado em placas de 6 poços a 4 × 105 células/bem e incubar em 2 mL de DMEM completo a 37 °C com 5% de CO2 durante a noite para permitir que as células se conectem à placa. Remova o meio de cultura e lave as células três vezes com soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS). Adicione 1 mL de tampão HBSS/HEPES contendo (ou não, para controles) 1 U/mL de Coase, e incubar por 1h a 37 °C com 5% de CO2. Substitua o médio por 1 mL de HBSS/HEPES contendo 0,1 U/mL de Coase e incuba por 1h a 37 °C com 5% de CO2. Remova a solução e colmeia as células. Lave as células três vezes com PBS, e centrífuga a 400 × g por 5 min a temperatura ambiente. Lise as células com tampão de ensaio radioimunoprecipitação (25 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM, MgCl2, 1 mM de ácido tetraacetice de etilenodiamina, 2% glicerol, protease e coquetel inibidor de fosfatase) para 30 mm de gelo. Centrifugar os lises a 10000 × g por 10 min a 4 °C e coletar o sobrenante. Quantifique a concentração total de proteínas para cada amostra por ensaio proteico modificado de Bradford usando a solução de trabalho de acordo com as recomendações do fabricante. Medição da concentração de colesterol Para determinar o nível total de colesterol celular enzimaticamente, use o kit apropriado (por exemplo, Amplex Red Colesterol Assay Kit) de acordo com as recomendações do fabricante. Para cada reação, misture a amostra contendo 5 μg de proteína com reagente vermelho amplex/peroxidase/colesterol oxidase/colesterol esterase solução de trabalho, e incubar por 30 min a 37 °C no escuro. Meça a fluorescência usando excitação de 520 nm e detecte a emissão em 560-590 nm usando um leitor de microplaca. Subtraia o fundo do valor final e determina a concentração de colesterol usando uma curva padrão. Calcule o teor final de colesterol em ng de colesterol por μg de proteína.

Representative Results

Geramos um DL para Thy1-GFP expresso em células Cos-7 (Figura 4, quadrados pretos). A lei de difusão tem um valor t0 positivo (19,47 ms ± 2 ms), indicando que o Thy1-GFP está confinado em estruturas de nanodomína da membrana plasmática. O tratamento oxidase de colesterol das células expressando Thy1-GFP resultou na mudança do valor DL t0 para 7,36 ± 1,34 ms (Figura 4, quadrados cinza). Esta observação confirma que a natureza do confinamento Thy1-GFP depende do teor de colesterol e está associada a nanodomínios de jangada lipídica. Essas duas leis de difusão mostram-se diferentes de acordo com o teste estatístico descrito acima (ver etapa 9.1.3) em termos de valores t0 e Deff . Além disso, avaliamos a concentração de colesterol celular total em células Cos-7 não tratadas versus as células tratadas com COase. Uma pequena, mas significativa, diminuição do teor total de colesterol é observada no tratamento de COase (Figura 5). Como esta enzima age apenas na piscina de colesterol acessível no folheto externo da membrana plasmática, assumimos que a diminuição observada no colesterol está associada apenas à membrana plasmática e resulta na desestabilização dos nanodomínios lipídes de jangada. Figura 1: Leis simuladas de espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) estabelecidas por FCS de variação spot para diferentes formas de organização da membrana. (Painéis superiores) Representação esquemática da organização da membrana — (A) livre difusão, (B) barreiras de malha e (C) confinamentos de trap/domínio — com a trajetória desenhada para uma única molécula (vermelho). Círculos azuis denotam a intersecção da membrana e do raio laser da cintura ω. (Painéis inferiores) As leis de difusão fcs representadas pelo plotagem do tempo de difusão td em função do raio quadrado ω2. A projeção da lei de difusão (linha de traço verde) intercepta o eixo temporal em (A) a origem (t0 = 0) no caso de difusão livre; (B) em eixo negativo (t0 < 0) quando houver barreiras de malha, ou (C) em eixo positivo (t0 > 0) quando há armadilhas e domínios (jangadas lipídicas). D é o coeficiente de difusão lateral para o movimento browniano; Deff, o coeficiente de difusão eficaz; Dmicro, o coeficiente de difusão microscópica dentro das armadilhas de malha; Din, o coeficiente de difusão dentro dos domínios; Dfora, o coeficiente de difusão fora dos domínios; L, o tamanho do lado de um domínio quadrado; e rD, o raio de um domínio circular. Este valor foi modificado de Ele e Marguet6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Visão esquemática do controle de hardware svFCS. O computador controla todos os dispositivos através de diferentes protocolos de comunicação: serial (microscópio, obturador externo), USB (estágio piezoelétrico XYZ, correlator) e PCI (placa de aquisição). DAQ: data acquisition board, APD: avalanche photodiode, SPCM: módulo de contagem de fótons únicos, DO: saída digital. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Visão esquemática dos caminhos ópticos de excitação e emissão da configuração svFCS. A configuração svFCS contém quatro módulos: (1) a saída de um laser de fibra de 488 nm é colidida, (2) uma combinação de uma placa de meia onda e divisor de feixe polarizador define a potência óptica, (3) o raio laser focado na amostra depois de viajar através de um microscópio motorizado livre de lentes de tubo, e (4) a fluorescência é detectada através de um caminho de detecção semelhante ao semelhante a um fódio de avalanche acoplado a um único módulo de contagem de fótons, que fornece um sinal para um correlator de hardware. A simplicidade dá ao sistema sua sensibilidade, robustez e facilidade de uso (amplamente comentada em material suplementar). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: As leis de difusão svFCS geradas a partir da análise de difusão do Thy1-GFP expressas no Cos-7. svFCS leis de difusão de células Cos-7 sem tratamento (NT, quadrados pretos) e após tratamento oxidase de colesterol (COase, círculos cinzentos). A inserção no gráfico representa testes estatísticos de diferença significativa entre as duas leis de difusão svFCS apresentadas (segundo Mailfert et al.28). O valor do teste (T) deve estar acima do limite fixado em 3,8 quando ambas as leis de difusão forem diferentes. Quanto maior for, maior é a diferença entre as leis de difusão. O valor de T é codificado por cores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Comparação do teor total de colesterol nas células Cos-7. As células Cos-7 foram não tratadas (NT) ou tratadas com 1 U/mL de colesterol oxidase (COase) por 1 h. Os dados representam um exemplo de um experimento em triplicado. Utilizou-se um teste t de duas caudas e não remunerados para avaliar a diferença estatística (α=0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Tabela de materiais: A lista de elementos ópticos necessários para a configuração svFCS. Material suplementar: Este documento descreve a construção de uma configuração svFCS do zero. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Aqui, descrevemos a implementação do módulo svFCS em um microscópio fluorescente padrão, uma abordagem experimental poderosa para decifrar a dinâmica da organização da membrana plasmática em células vivas graças à análise da lei de difusão fcs. Conceitualmente, o svFCS baseia-se em um princípio simples: medidas de correlação de fluorescência no domínio do tempo, variando o tamanho da área de iluminação23. Essa estratégia tem sido fundamental para deduzir informações nanoscópicas de medições microscópicas, o que ajuda a decifrar os principais elementos físico-químicos que contribuem para a organização da membrana plasmática em estado estável25 e processos fisiológicos 30,31,32,33. Ao todo, essas análises svFCS demonstram inequivocamente a existência de nanodomínios dependentes de lipídios em vários tipos de células e sua implicação direta na sintonia de diferentes eventos de sinalização.

Dentro deste quadro, existem alguns aspectos ópticos que precisam ser considerados durante a construção da configuração svFCS para otimizar o orçamento do fóton e minimizar aberrações ópticas. Assim, recomendamos o uso de um microscópio do qual a lente do tubo pode ser removida quando a medição svFCS é realizada. Além disso, uma única íris desempenha um papel fundamental na configuração svFCS: altera o tamanho do feixe na abertura traseira do objetivo, variando diretamente o tamanho efetivo da cintura (ou seja, o volume de excitação eficaz). O diâmetro do feixe deve caber na pupila traseira objetiva para obter o menor tamanho da cintura34. Essa opção, que ajuda a ajustar o tamanho da cintura, garante a otimização do orçamento do fóton e é fácil de implementar. Finalmente, um número mínimo de peças ópticas são usadas ao longo do caminho da luz; quanto menos complexo o sistema, menos os fótons que são perdidos. Todas essas opções melhoram significativamente a robustez dos experimentos svFCS.

Em relação ao protocolo em si, alguns passos críticos devem ser considerados. O mais importante é um alinhamento adequado dos caminhos ópticos que é crucial para medições svFCS bem sucedidas (protocolo, seção 2). Isso é fácil de verificar analisando o sinal de fluorescência de uma solução 2 nM Rh6G, que deve ser ~200 kHz sob iluminação laser de 300 μW. Todas as íris devem ser abertas, e os ACFs devem ter uma amplitude importante (tipicamente G0~1,5-2.0). Outro ponto crítico diz respeito às células e à sua preparação para a análise do SVFCS (protocolo, seções 4-8). Sua densidade deve ser adaptada para que as células isoladas sejam observadas para análise. As células não aderentes devem ser imobilizadas em um vidro de cobertura com câmara usando a solução de poli-L-lysine. O sinal de fluorescência da rotulagem celular não deve ser muito forte, ou resultará em ACFs muito planos que são difíceis de encaixar, e os parâmetros de ajuste são sobrecarregados com um erro importante. Além disso, a rotulagem nonhomogógena e os agregados de fluorescência nas células tornam as medidas svFCS extremamente difíceis de interpretar. Finalmente, o tratamento oxidase do colesterol afeta a viabilidade celular, e a análise do svFCS não deve exceder uma hora após o tratamento. Também é melhor registrar as flutuações de fluorescência da membrana plasmática superior, pois não está ligada ao suporte, e não há risco de difusão dificultada de moléculas devido às interações físicas com o suporte.

Houve avanços suficientes na técnica svFCS para seu uso em diferentes abordagens devido à diversidade de modalidades para ajuste do volume de detecção, possibilitando o estudo de diversos processos biológicos em células vivas. Uma alternativa para ajustar o tamanho do volume de excitação é usar um expansão de feixe variável35. Também é possível simplesmente modular o tamanho da área de iluminação registrando o sinal fluorescente a partir da interceptação da membrana plasmática ao longo da direção z36. Isso pode ser feito em um microscópio confocal padrão para o qual foi desenvolvido um arcabouço teórico para derivar a lei de difusão 37,38.

Embora o método svFCS ofereça resolução espátula-temporal, necessária para a caracterização da organização lateral inhomogênea da membrana plasmática, os modos geométricos de confinamento não são mutuamente exclusivos. Um desvio de t0 em uma direção ou outra revela exclusivamente um modo dominante de confinamento25. Além disso, outra limitação importante do presente método svFCS resulta do limite clássico de difração óptica (~200 nm). Isso é inquestionavelmente maior do que os domínios que confinam as moléculas dentro da membrana plasmática celular. Portanto, a análise do confinamento é inferida a partir do valor t0 , extrapolado da lei de difusão.

Essa desvantagem foi superada pela implementação de métodos alternativos. Inicialmente, o uso de películas metálicas perfuradas com nanoaperaturas oferecia a possibilidade de iluminar uma área de membrana muito pequena (ou seja, abaixo do limite de difração óptica de aberturas nanométricas únicas de raios variando entre 75 e 250 nm)39. Assim, foi relatado o regime de transição previsto a partir da lei de difusão teórica para organização de domínios isolados, permitindo um refinamento do tamanho característico das heterogeneidades da membrana nanométrica e uma estimativa quantitativa da área superficial ocupada por nanodomínios dependentes de lipídios39. Alternativamente, a iluminação nanométrica também foi desenvolvida usando microscopia óptica de varredura de campo próximo40 ou nanoantennas ópticasplanar 41. Mais recentemente, a combinação de esgotamento estimulado de emissões (STED) e FCS forneceu uma ferramenta poderosa e sensível para documentar a lei de difusão com resolução espacial muito alta. Este STED-FCS dá acesso a características de difusão molecular em uma nanoescala que ocorre dentro de um curto período de tempo, permitindo o estudo da organização dinâmica de sondas lipídicas na membrana plasmática42,43. No entanto, a supressão incompleta da fluorescência no processo STED desafia a análise das curvas de auto correlação em FCS.

Um novo modelo de montagem foi desenvolvido para superar essa dificuldade, melhorando a precisão dos tempos de difusão e medições médias dos números de moléculas44. Finalmente, para difusão molecular lenta na membrana plasmática, o princípio svFCS pode ser aplicado a dados registrados pela espectroscopia de correlação de imagem45. Recentemente, foi demonstrado que a combinação da microscopia de força atômica (AFM) com a imagem total de reflexão interna-FCS (ITIR-FCS) contribui para o refinamento da natureza do mecanismo que dificulta a difusão molecular na membrana plasmática, especialmente perto da configuração da membrana do limiar de percolação devido a uma alta densidade de nanodomínios46.

Em conclusão, a criação da lei de difusão pela SVFCS forneceu evidências experimentais para inferir a heterogeneidade local criada por lipídios coletivos dinâmicos e associações de proteínas de membrana. Como afirmado por Wohland e seus colegasde trabalho 46, “a análise da lei de difusão da FCS continua sendo uma ferramenta valiosa para inferir características estruturais e organizacionais abaixo do limite de resolução de informações dinâmicas”. Ainda assim, precisamos desenvolver novos modelos para refinar a interpretação da lei de difusão que deve permitir uma melhor compreensão da dinâmica dos eventos moleculares que ocorrem na membrana plasmática.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SB, SM e DM foram apoiados pelo financiamento institucional do CNRS, Inserm e Aix-Marseille University e bolsas de programa da Agência Nacional de Pesquisa Francesa (ANR-17-CE15-0032-01 e ANR-18-CE15-0021-02) e o francês “Investissement d’Avenir” (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). A KW reconhece o “BioTechNan”, um programa de estudos interdisciplinares de doutorado ambiental KNOW na área de Biotecnologia e Nanotecnologia. A EB reconhece o apoio financeiro do Centro Nacional de Ciência da Polônia (NCN) sob o projeto nº 2016/21/D/NZ1/00285, bem como do Governo francês e da Embaixada da França na Polônia. MŁ reconhece o apoio financeiro do Ministério do Desenvolvimento polonês (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) e do Centro Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). A TT reconhece o apoio financeiro do Centro Nacional de Ciência da Polônia (NCN) sob o projeto nº 2016/21/B/NZ3/00343 e do Centro de Biotecnologia Wroclaw (KNOW).

Materials

Aligment tool Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings Thorlabs SPW602
Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM) Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode Excelitas SPCM-AQRH-15
BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m RS Components 742-4315
Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2 RS Components 885-8172
Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz RS Components 546-4948
Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V RS Components 768-5500
Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C RS Components 452-8394
Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter RS Components 792-4079
Fluorescence filtering 535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm AHF filter F47-539
Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm AHF filter F43-088
496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25 AHF filter F37-496
Hardware correlator 80 MHz Digital Correlator Correlator.com Flex02-12D
Laser LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW Lasos BLD-XT 488100
Laser safety High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll Thorlabs T743-2.0
Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets Thorlabs MC-5
Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission Thorlabs LG3B
Microscope Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope
Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters		 Carl Zeiss
C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS
(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR		 Carl Zeiss 421767-9971-711
Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5" Carl Zeiss 000000-1698-345
Middle ring W0.8 – W0.8 H "5" Carl Zeiss 000000-1698-347
Optical path D25.4mm Mirror, Protected Silver Thorlabs PF10-03-P01
D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat Thorlabs AC254-060-A
D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat Thorlabs AC254-035-A
25 µm mounted pinhole Thorlabs P25S I
25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm Thorlabs WPH10M-488 (HWP)
20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm Thorlabs PBS201
Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID Thorlabs RSP1/M
52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount Thorlabs KM100B/M
Adjustable Prism Clamp Thorlabs PM3/M
Beam block – active area 19 mm x 38 mm Thorlabs LB1/M
Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture Thorlabs ID25/M
Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount Thorlabs KM100CL
1" Optic Holder, M4 Tap Thorlabs MFF101/M
1" Stackable Lens Tube Thorlabs SM1L03
Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½ Thorlabs SM1L05
Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2" Thorlabs SM1L20
Small Optical Rails 600mm, metric Thorlabs RLA600/M
Small Optical Rails 75mm, metric Thorlabs RLA075/M
Small Optical Rails 150mm, metric Thorlabs RLA150/M
Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1" Thorlabs RC1
Rail Carrier, Perpendicular Dovetail Thorlabs RC3
High Precision Translating Lens Mount for 1 inch Thorlabs LM1XY/M
½ " (12mm) Dovetail Translation Stage Thorlabs DT12/M
Rail Clamps Thorlabs CL6
Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102) Thorlabs PT3/M
Black Rubberized Fabric Thorlabs BK5
Ball Driver kit/ 6 tools Thorlabs BD-KIT/M
Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads Thorlabs AP6M4M
Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack Thorlabs BA1S/M-P5
Lens Mount for 25.4mm optic Thorlabs LMR1/M
SM1 FC/APC Adapter Thorlabs SM1FCA
Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics Thorlabs KM100
Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW Thorlabs S120C
12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew,
L=50 mm, 5 Pack		 Thorlabs PH50/M-P5
Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm Thorlabs PH20/M
12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole, 5 Pack		 Thorlabs TR50/M-P5
12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole, 5 Pack		 Thorlabs TR75/M-P5
USB Power and Energy Meter Interface Thorlabs PM100USB
12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole		 Thorlabs TR30/M
12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole		 Thorlabs TR20/M
750 mm long Structural Rail (detection box) Thorlabs XE25L750/M
350 mm long Structural Rail (detection box) Thorlabs XE25L350/M
Quick Corner Cube for 25 mm Rails Thorlabs XE25W3
Right-Angle Bracket for 25 mm Rails Thorlabs XE25A90
Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets Thorlabs TB5
Hinge for 25 mm Rail Enclosures Thorlabs XE25H
Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures Thorlabs XE25LS
M4 Cap Screw Kit Thorlabs HW-KIT1/M
M6 Cap Screw Kit and Hardware kit Thorlabs HW-KIT2/M
Table Clamp, L-Shape, 5 Pack Thorlabs CL5-P5
SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 – Ø12 mm) Thorlabs SM1D12D
Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole Thorlabs DG10-1500-H1-MD
Honeycomb Optical Table Top, Standa Standa 1HB10-15-12
Optical Table support, Standa Standa 1TS05-12-06-AR
Sample nano-positionning Precision XYZ Nanopositioning Physik Instrumente PI P527-3.CD
Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V
Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,		 Physik Instrumente PI E727-3.CD
Temperature chamber Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK Digital Pixel
Dual Channel Microprocessor Temperature Controller Digital Pixel DP_MTC_2000_DUO
Two Vibration Free Heater Modules Digital Pixel DP_150_VF
PT100 Temperature Sensor Digital Pixel DP_P100_TS
Biological Reagents and Materials
Cell culture and transfection Cos7 cells ATCC® CRL-1651™
8- well Lab-Tek chambers Thermo Fisher Scientific 155411PK
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 16000044
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
PBS buffer Thermo Fisher Scientific 14190144
PenStrep Thermo Fisher Scientific 15140122
PolyJet Transfection Reagent SignaGen Laboratories SL100688
Cholesterol content measurement Amplex Red Cholesterol Assay Kit Thermo Fisher Scientific A12216
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 87786
Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78420
ROTI Nanoquant Working Solution Roth K880
GloMax Discover Microplate Reader Promega GM3000
svFCS measurements HBSS buffer Thermo Fisher Scientific 14025092
Hepes buffer Thermo Fisher Scientific 15630080
Cholesterol oxidase Sigma-Aldrich C8868
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich 83697-1G
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Mailfert, S., Wojtowicz, K., Brustlein, S., Blaszczak, E., Bertaux, N., Łukaszewicz, M., Marguet, D., Trombik, T. Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells. J. Vis. Exp. (165), e61823, doi:10.3791/61823 (2020).
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