生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

1. カスタムメイドのsvFCSセットアップを組み立てるための設定仕様 注:提案されたsvFCSセットアップのシンプルさにより、光子回復の効率を確保しながら、低コストで簡単な設置、操作、およびメンテナンスが可能になります。詳細については、「 補足資料」を参照してください。 実験室と安全性 約21°Cで安定した部屋にシステムを設置します。 パッシブ(またはアクティブ)光学テーブル上の直接の気流を避け、光学アライメントのレーザー安全規則に従ってください。 ハードウェアとソフトウェアメモ: 補足資料 では、図 2 に示すインストール手順 の詳細を参照してください。 LabVIEWでは、多機能集録ボードがほとんどのコントローラを駆動するステートマシンとイベントストラクチャーアーキテクチャを使用して、メインの集録/制御ソフトウェアを作成します。メモ: 相関器、レーザー、およびパワーメータは、独自のソフトウェアによって制御または監視されます。 ハードウェアおよびソフトウェアのインストール手順は、使用するハードウェアに応じて調整します。 オプティカル・セットアップメモ: 図 3 は、次のセクションで光アライメントの品質を制御するために使用される光ベンチモジュールを示しています。すべての光学素子の仕様は、 材料表に記載されています。セットアップを構築する手順は、補足資料で広く詳しく 説明されています。このシステムは、連続波レーザー、浸漬水対物レンズを備えた電動倒立顕微鏡、単一の光子計数モジュールに結合されたアバランシェフォトダイオード検出器、およびハードウェア相関器で構成されています。振動のないヒーターを備えた顕微鏡インキュベーションチャンバは、生細胞での実験のための温度を制御するために特別に設計されています。慣例により、XY軸は光路の垂直平面に対応し、Z軸は光路に対応する。 2. 実験実施前の毎日のチェックポイント 励起経路を制御します(図3、 および)。 すべてのアイリスダイヤフラムを開きます。 パワーメーターでレーザー出力を測定し、最初の虹彩を完全に開いたままにします。 半波長板(HWP)を回して最大電力を求めます。 レーザー出力が通常よりも低い場合は虹彩を使用してアライメントを確認し、必要に応じてL1とM1を交互に動かします。 実験実験ノートの検出力値に注意してください。 検出パスを制御します(図3、 &)。 水、カバースリップ、および2 nMローダミン6G(Rh6G)溶液の液滴を対物レンズの上に置きます。 蛍光信号(APDのカウント数、LabVIEWソフトウェアで記録)が通常よりも低い場合は、Rh6Gソリューションを作り直し、対物レンズの位置とカバースリップの番号を確認するか、気泡がある場合は除去します。 蛍光信号が通常よりも低い場合は、パワーメーターを光路の内側に配置してビームをブロックします。 APDをオフにします(以下、APDはAPDと単一光子計数モジュールを指します)。 サンプルを削除します。 対物レンズをクリーニングし、反射ターゲットと交換します。 光路からパワーメーターを取り外して、反射ターゲットのレーザービームを確認します。ターゲットのビームが中央に配置され、後方反射がライン 上の最初の虹彩に達することを確認します(図3)。 そうでない場合は、M2でセンターの位置決めを調整するか、ダイクロイックミラーで背面反射を調整します。 顕微鏡の結合が正しければ、対物レンズを押し戻し、水滴、カバースリップ、およびより濃縮されたRh6G溶液(すなわち、200nM)の液滴を加え、従来の測定(数μW)よりも低いレーザー出力を設定します。 APDをオンにし、強度信号を監視しながら、それぞれのXYZ調整ネジでAPDとピンホールの位置合わせを交互に最適化します(LabVIEWソフトウェア)。 カバースリップを変更し、低濃度のRh6G(2nM)を追加します。ピンホールをZ軸に沿って動かして、分子の輝度比が大きくなり、ウエストが最小になる位置を見つけます。 信号が下がるまで虹彩を閉じます:レーザービームサイズは対物レンズの背面開口サイズに達します(すなわち、最小ウエストサイズ、 補足資料を参照)。 相関関係子ソフトウェアを起動し、データを記録します(データ記録についてはセクション7を参照)。 ACFを確認すると、低ノイズが表示され、ウエストサイズが小さく、1分子あたりのカウントレートが1秒あたりに高くなります(データ分析とウエストサイズ評価についてはセクション7を参照)。 3. svFCS データの記録と分析に関する一般的な考慮事項 (1)蛍光記録およびACF生成(相関関係子ソフトウェア)、(2)データの予期しない廃棄、保持データの平均、適切なモデルとのフィッティング(自家製Igor Proソフトウェアを使用)、(3)拡散法則プロット(自家製MATLABソフトウェア1)、および(4)オプションの拡散法則比較(自家製MATLABソフトウェア2)。さまざまなソフトウェアプログラムは、要求に応じて利用可能です。メモ: ハードウェア相関器の最小サンプリング時間は 12.5 ns (サンプリング周波数 80 MHz) です。これは、溶液中の自由に拡散する小分子の典型的な常駐時間よりも少なくとも1,000低く、共焦点観察体積内の膜タンパク質の拡散時間よりも106 小さい時間分解能を提供する。 4. 細胞培養とトランスフェクション 5%ウシ胎児血清、ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 U/mL)、およびL-グルタミン(1 mM)を添加した完全なダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)を使用して、8ウェルチャンバーカバーガラスに#1.0ホウケイ酸ガラス底に10,000細胞/ウェルの密度でCos7細胞を播種します。 細胞を5%CO2を含む加湿雰囲気中で37°Cで24 時間培養する。 培地を除去し、1ウェルあたり300μLの新鮮な完全培養培地を添加し、細胞を37°Cで30分間プレインキュベートした。 eGFP 25と融合させたThy-1タンパク質をコードするプラスミドDNAを0.5μg、無血清DMEM の50μLで希釈する。渦は簡単に混ぜる。 1.5 μL の DNA トランスフェクション試薬を 50 μL の無血清 DMEM に希釈し、溶液をよく混合します。 希釈したトランスフェクション試薬を調製したDNA溶液に直接加え、直ちに化合物を混合する。 調製した混合物を室温で10〜15分間インキュベートする。 結合されたDNA/トランスフェクション試薬複合体を各ウェルの培地上に10μL滴下し、プレートを穏やかに旋回させてホモジナイズする。 細胞を37°Cで5%CO2 で3時間インキュベートする。 インキュベーション後、DNA/トランスフェクション試薬複合体を含む培地を400μLの新鮮な完全DMEMと交換し、svFCS実験の前に細胞を16時間培養します。 5. svFCS測定用細胞の調製 培養液を除去する。 10 mM(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)、pH 7.4(HBSS/HEPES)を添加したCa2+ およびMg2+ を含む無血清ハンクス平衡塩溶液(HBSS)バッファーで細胞を2〜3回穏やかに洗浄します。 すべてのsvFCS取得中にHBSS/HEPESバッファー内のセルを維持します。 6. 薬理学的治療 培養液を取り出し、10 mM HEPES、pH 7.4(HBSS/HEPES)を添加した無血清HBSSで細胞を2~3回洗浄します。 HBSS/HEPESバッファー中の1 U/mLのコレステロールオキシダーゼ(COase)溶液で細胞を37°Cで1時間インキュベートします。 溶液を除去し、svFCS測定を行いながら、HBSS/HEPESバッファー中の0.1 U/mLのCOaseの存在下で細胞を維持します。 7. スポットサイズキャリブレーション 顕微鏡チャンバーを37°Cで予温する。 段階希釈によりRh6Gの標準2nM溶液を調製する。 2 nM Rh6G 溶液 200 μL を水浸漬対物レンズ上に置いたガラスカバースリップに滴下します。 すべてのハードウェアとソフトウェアを起動します。 使用する蛍光プローブの輝度と光安定性に応じて、(1)安定している蛍光強度(LabVIEWソフトウェア上)、(2)ACF形状(相関器ソフトウェア上)に従って、この電力を適合させます。 (3)小さなウエストサイズと1分子あたりの高い計数率(毎秒1分子あたりの光子、典型的には毎秒1分子あたり数十〜数百の光子)を与えるフィッティングパラメータ。注:ACF(G(0)と呼ばれる)の振幅は、分子の数(すなわち、蛍光プローブの濃度)に反比例する。ウエストサイズのキャリブレーションの場合、これは優れた品質管理候補パラメータです。したがって、G(0)は、ウエストのサイズと濃度をリンクさせるため、毎日同じ濃度で類似している必要があります。細胞測定では、FCSは低濃度の方が正確であるため、適切なパラメータフィッティング抽出ではG(0)を高くする必要があります。 svFCS照明/検出顕微鏡ポートをLabVIEWソフトウェアで設定します。 APD をオンにします。 信号が下がるまで虹彩を閉じて最小のウエストサイズを得るか、ウエストサイズを大きくするために閉じます。 統計的再現性を向上させるために、選択した期間(すなわち実行)のいくつかのACF(通常は相関器ソフトウェアでそれぞれ20秒間持続する10回の実行)を記録します。 APD をオフにします。 Igor Proソフトウェアを使用して、分子集合体による強い変動を伴う実行を確認して破棄します。この手順は手動で実行します — ユーザーがトレーニングを受けた後は、ユーザーに依存しない必要があります。 保持された ACF の平均を 3D 拡散モデルに当てはめます。 フィッティングパラメータから平均拡散時間 を抽出し、「.txt」ファイルに保存します(ファイル形式はIgor Proソフトウェアによって決定されます)。 平均強度(蛍光トレースから抽出)を分子数(ACFから抽出)で割ることによって、1 秒あたりの 1 分子あたりのカウント速度 (良好なパフォーマンス指標) を確認します。メモ:この値が高く、同じ集録パラメータに対して日常的に安定していることを確認してください。 37°Cにおける水溶液中のRh6Gの拡散係数(D)を知り(7.13参照)、以下に従って実験ウエストサイズωを計算する。 FCS拡散法則をプロットするために必要なすべてのウエストサイズ変更に対して、およびsvFCSデータ集録の新しい実験シリーズの前に、手順を適用します。 8. セル上のsvFCSデータ集録 488 nmのビームパワーを2~4 μWの間で測定および調整します。使用する蛍光プローブの輝度と光安定性に応じて、このパワーを調整して、フォトブリーチングを低く保ちながら(つまり、LabVIEWソフトウェアで安定した強度トレースを)、1分子あたり高いカウントレート(通常は1分子あたり毎秒数千個のフォトン)を実現できるようにします。 測定を開始する前に、サンプルを37°Cで10分間平衡化します。 落射蛍光照明顕微鏡をLabVIEWソフトウェアで設定します。 適切な蛍光プローブの位置と(低い)蛍光シグナル強度を持つ細胞を選択します。メモ:蛍光が低いほど、FCS測定値は良好です(ステップ8.1を参照)。 svFCS照明/検出顕微鏡ポートをLabVIEWソフトウェアで設定します。 APD をオンにします。 選択したセルをLabVIEWソフトウェアでxyスキャンを実行します。 zスキャンを実行し、上部の原形質膜を選択して最大蛍光強度で共焦点スポットを見つけ、データ取得を開始します。2つの膜間の分離を最大にするために、好ましくは細胞の核領域においてスキャンを行う。 5秒間持続する20回の実行の1つのシリーズを、それぞれ相関関係子ソフトウェアで記録します。メモ: 各実行の時間が、ノイズの少ない ACF を取得するのに十分な長さであることを確認してください。長い買収は、フォトブリーチングまたは予期せぬ実質的な変動(例えば、凝集体)の影響を受けやすい。実行数、持続時間、および系列数をサンプルに適合させますが、再現性のために同じ実験の大部分内で一定であることを確認してください。 APD をオフにします。 Igor Pro ソフトウェアで予期しない実行を破棄します。 平均ACFを2種の2D拡散モデルに当てはめます。このモデルを標的分子の拡散挙動のタイプに適合させる。 継ぎ手パラメータを前のファイルに保存します(ステップ7.13を参照)。 少なくとも 10 個の異なるセルで 10 ~ 15 回の一連の記録を実行し、ステップ 8.3 ~ 8.13 を再現します。取得した単一のファイルに、ウエストサイズ情報と10〜15枚の録音のフィッティングパラメータが含まれていることを確認してください。 単一の拡散法則を確立するには、200〜400nmの間で変化する少なくとも4つのウエストサイズを分析します。この範囲は回折光学限界によって定義されますが、対物レンズ(開口数)とレーザー(波長)に依存します。注:ウエストサイズのキャリブレーションは絶対的ではなく、ある程度の不確実性があるため、xおよびy誤差(すなわちω2およびtd)を考慮に入れた専用のMATLABソフトウェア28が拡散法則に合うように構築されました。 MATLABソフトウェア1を起動し、少なくとも4つのウエストサイズの実験に対応するすべての「.txt」ファイルを含むフォルダを選択します。 プロット<d>対<ω2>、すなわち拡散の法則ではない。2つの主要なパラメータを抽出することができます:y軸切片(t0)と有効拡散係数(Deff、傾きに反比例)。 9. 異なる実験条件比較の拡散法則 注:必要に応じて、異なる実験条件のセクション7と8を再現してください。これらの拡散法則がt0およびD eff値28に従って類似しているかどうかを判断するために、専用ソフトウェア(MATLABソフトウェア2)が開発されました。2 つの仮説 (2 つの値が異なるか、または誤警報 (PFA) の確率より上に設定されたしきい値で 2 つの値が異なっていないかの 2 つの仮説をテストします。5%の任意のPFA値(T = 3.8)は、2つのパラメータ(t0またはDeff)間の有意性の上限と見なされ、2つの値が同一である確率は5%しかないことを示します。 比較する各条件の特性拡散則値を含む「.xls」ファイルを作成します(つまり、未処理(NT)および処理済み(COase)条件のt0、t0エラー、DeffおよびDeffエラーを含むファイルをテーブルとして)。 MATLAB ソフトウェア 2 を起動します。 「.xls」ファイルを選択します。 生成された色分けされた2Dプロットを分析します。ここで、t0とDeff統計検定は、それぞれX軸とY軸にプロットされます(図4)。Tが高いほど、比較された値の差は大きくなります。 10. コレステロール濃度測定 細胞処理と溶解 Cos7細胞を4 ×105 細胞/ウェルの6ウェルプレートに3連で播種し、37°Cで2mLの完全DMEM中で5%CO2 で一晩インキュベートして、細胞がプレートに付着できるようにします。 培養液を取り出し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄した。 1 U/mLのCoaseを含む(または対照用ではない)HBSS/HEPESバッファー1 mLを加え、5%CO2と共に37°Cで1時間インキュベートします。 培地を0.1 U/mLのコースを含む1 mLのHBSS/HEPESと交換し、5%CO2と共に37°Cで1時間インキュベートします。 溶液を取り除き、細胞を回収する。 PBSで細胞を3回洗浄し、室温で400× g で5分間遠心分離する。 細胞をラジオイムノ沈降アッセイバッファー(25 mM HEPES、pH 7.4、150 mM NaCl、1% NP40、10 mM、MgCl 2、1 mM エチレンジアミン四酢酸、2% グリセロール、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル)で氷上で30分間溶解します。 溶解液を10000× g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を回収する。 メーカーの推奨に従って、作業溶液を使用した修正ブラッドフォードのタンパク質アッセイによって、各サンプルの総タンパク質濃度を定量します。 コレステロール濃度測定 酵素的に総細胞コレステロール値を決定するには、メーカーの推奨に従って適切なキット(例えば、Amplex Red Cholesterol Assay Kit)を使用してください。 各反応について、5μgのタンパク質を含むサンプルをAmplex Red試薬/西洋ワサビペルオキシダーゼ/コレステロールオキシダーゼ/コレステロールエステラーゼ作用溶液と混合し、暗所で37°Cで30分間インキュベートする。 520 nmの励起を使用して蛍光を測定し、マイクロプレートリーダーを使用して560〜590 nmでの発光を検出します。 最終値からバックグラウンドを減算し、標準曲線を使用してコレステロール濃度を決定します。 タンパク質のμgあたりのコレステロールのngで最終的なコレステロール含有量を計算します。