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Biochemistry

Spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot per l'analisi della diffusione molecolare sulla membrana plasmatica di cellule viventi

Published: November 12, 2020
doi:
10.3791/61823
, , , , , , ,
1CNRS, Inserm, Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Aix Marseille Univ, 2Faculty of Biotechnology,University of Wroclaw, 3Faculty of Biological Sciences,University of Wroclaw, 4CNRS, Centrale Marseille, Institut Fresnel,Aix Marseille Univ

Summary

Questo articolo si propone di presentare un protocollo su come costruire un microscopio per spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS) per misurare la diffusione molecolare sulla membrana plasmatica delle cellule viventi.

Abstract

I processi biologici dinamici nelle cellule viventi, compresi quelli associati all’organizzazione della membrana plasmatica, si verificano su varie scale spaziali e temporali, che vanno rispettivamente dai nanometri ai micrometri e dai microsecondi ai minuti. Una gamma così ampia di processi biologici sfida gli approcci convenzionali alla microscopia. Qui, descriviamo in dettaglio la procedura per l’implementazione di misurazioni di spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS) utilizzando un microscopio a fluorescenza classico che è stato personalizzato. Il protocollo include uno specifico controllo delle prestazioni del setup svFCS e le linee guida per le misure di diffusione molecolare da parte di svFCS sulla membrana plasmatica di cellule viventi in condizioni fisiologiche. Inoltre, forniamo una procedura per interrompere i nanodomini della zattera della membrana plasmatica mediante il trattamento della colesterolo ossidasi e dimostriamo come questi cambiamenti nell’organizzazione laterale della membrana plasmatica potrebbero essere rivelati dall’analisi svFCS. In conclusione, questo metodo basato sulla fluorescenza può fornire dettagli senza precedenti sull’organizzazione laterale della membrana plasmatica con l’appropriata risoluzione spaziale e temporale.

Introduction

La complessità dell’organizzazione della membrana plasmatica
L’attuale comprensione dell’organizzazione della membrana cellulare deve tenere conto di diversi aspetti1. In primo luogo, una composizione lipidica complessa varia non solo tra i tipi di cellule, ma anche all’interno di una singola cellula (organelli di membrana / membrana plasmatica). Inoltre, le proteine di membrana associate o intrinseche sono per lo più organizzate in complessi multimerici dinamici, con grandi domini che si estendono al di fuori della membrana, rappresentando un’area significativamente più ampia di quella dei soli domini transmembrana. Inoltre, le proteine associate alla membrana mostrano specifiche capacità di legame lipidico o di interazione lipidica che svolgono un ruolo nella regolazione della funzione proteica. Questi dipendono direttamente dalla composizione locale e dall’accessibilità dei lipidi2.

Infine, si osserva un livello significativo di asimmetria tra due foglietti di membrana a causa della struttura asimmetrica intrinseca delle proteine di membrana e della distribuzione dei lipidi. Infatti, un equilibrio metabolico lipidico tra sintesi e idrolisi, combinato con flip-flop lipidico tra i foglietti, genera tale distribuzione asimmetrica. Poiché qualsiasi trasporto attraverso il doppio strato è limitato dall’energia libera necessaria per spostare il gruppo di testa polare attraverso l’interno idrofobo delle membrane, di solito è assistito da trasportatori selettivi. Per ogni tipo di cellula, l’asimmetria tende ad essere mantenuta saldamente. Complessivamente, questi fattori contribuiscono alla disomogeneità laterale o alla compartimentazione della membranaplasmatica 3,4.

Arricchiamo questa rappresentazione della membrana plasmatica tenendo conto della diffusione molecolare intrinseca all’interno e attraverso il doppio strato, che contribuisce all’eterogeneità laterale dinamica su una scala da decimi a centinaia di nanometri e microsecondi a secondi. Ad esempio, i nanodomini di membrana lipidici-dipendenti – le cosiddette zattere lipidiche, definite come colesterolo, e le piattaforme di segnalazione ricche di sfingolipidi – contribuiscono alla compartimentazione della membranaplasmatica 5,6. Tuttavia, l’attuale visione dell’organizzazione della membrana non è limitata alle sole zattere lipidiche. I nanodomini di membrana sono più complessi ed eterogenei per composizione, origine e funzione. Tuttavia, la loro presenza sulla membrana plasmatica deve essere strettamente coordinata e le interazioni dinamiche tra proteine e lipidi sembrano essere importanti nella distribuzione spaziale e nella modifica chimica dei nanodomini di membrana 1,3,7,8.

Il principio svFCS e la sua applicazione per sondare l’organizzazione della membrana plasmatica
Sebbene siano stati fatti molti progressi nell’analisi dei domini di membrana, principalmente attraverso tecniche biofisiche, i determinanti che dettano l’organizzazione locale della membrana plasmatica devono essere raffinati con un’appropriata risoluzione spaziale e temporale. I determinanti basati sul tracciamento di singole molecole forniscono un’eccellente precisione spaziale e consentono la caratterizzazione di diverse modalità di movimento 9,10,11,12, ma hanno una risoluzione temporale limitata con i classici frame rate bassi della telecamera e richiedono uno sforzo più sperimentale per registrare un numero significativo di traiettorie. In alternativa, il coefficiente di diffusione dei componenti della membrana può essere valutato mediante Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)13 o Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)14. Quest’ultimo ha ricevuto maggiore attenzione, principalmente a causa della sua elevata sensibilità e selettività, volume di rilevamento microscopico, bassa invasività e ampia gamma dinamica15.

La base concettuale di FCS è stata introdotta da Magde e colleghi circa 50 anni fa16,17. Si basa sulla registrazione della fluttuazione dell’emissione di fluorescenza con un’alta risoluzione temporale (da μs a s)18. Nella sua versione moderna, le misurazioni nelle cellule viventi sono eseguite da un piccolo volume di eccitazione confocale (~ 0,3 femtolitri) posizionato all’interno di una regione di interesse (ad esempio, alla membrana plasmatica); il segnale di fluorescenza generato dalla diffusione di molecole fluorescenti che entrano ed escono dal volume di osservazione viene raccolto con una risoluzione temporale molto elevata (cioè il tempo di arrivo di ciascun fotone sul rivelatore). Quindi, il segnale viene calcolato per generare la funzione di autocorrelazione (ACF), da cui viene estratto il tempo medio td (tempo di diffusione) per il quale una molecola rimane all’interno del volume focale, insieme al numero medio di particelle, (N), presenti nel volume di osservazione, che è inversamente proporzionale all’ampiezza dell’ACF. Quest’ultimo parametro potrebbe essere un’informazione utile sulla concentrazione della molecola all’interno del volume di osservazione.

Da allora, un numero crescente di modalità FCS è stato implementato grazie al rapido sviluppo della strumentazione in biofotonica, che consente la descrizione dei fenomeni dinamici che si verificano nei sistemi viventi. Tuttavia, una specie molecolare sperimenterebbe una distribuzione più sovrapposta dei valori del coefficiente di diffusione, che di solito si riflette in una caratteristica di diffusione anomala, in cui le molecole si diffondono con una relazione non lineare nel tempo19, e difficoltà nell’identificare il significato biologico di questa sottodiffusione anomala. In passato, questa difficoltà è stata in qualche modo superata registrando la diffusione molecolare da parte di FRAP da aree di varie dimensioni, piuttosto che da una sola area, fornendo così ulteriori informazioni spaziali. Ciò ha permesso, ad esempio, la concettualizzazione dei microdomini di membrana 20,21,22.

Una traduzione di questa strategia in misure FCS (cioè la cosiddetta spettroscopia di correlazione di fluorescenza a variazione spot (svFCS)) è stata stabilita variando la dimensione del volume focale di osservazione, consentendo di registrare la fluttuazione della fluorescenza su diverse scale spaziali23. Pertanto, l’approccio svFCS fornisce informazioni spaziali indirette che consentono l’identificazione e la determinazione delle modalità di diffusione molecolare e del tipo di partizionamento della membrana (domini isolati rispetto a domini contigui24) delle molecole studiate. Tracciando il tempo di diffusione td in funzione delle varie scale spaziali definite dal valore di vita (ω), che corrisponde alla dimensione del raggio del fascio di rilevazione in questo caso23,25, si può caratterizzare la legge di diffusione di una data molecola in una data condizione fisiologica. L’svFCS è, quindi, un perfetto analogo al tracciamento a singola particella nel dominio del tempo26. Sotto il vincolo di diffusione browniana, ci si dovrebbe aspettare una relazione strettamente lineare tra il tempo di diffusione td e la vita ω (Figura 1)23,25. L’origine della deviazione della legge di diffusione da questo schema può essere attribuita a ragioni non esclusive, come la rete citoscheletrica, l’affollamento molecolare, il partizionamento dinamico nei nanodomini o qualsiasi combinazione di questi e altri effetti (Figura 1), e deve essere testata sperimentalmente25.

Qui forniamo tutti i checkpoint di controllo necessari per l’uso quotidiano di un sistema ottico svFCS su misura costruito da zero, che integra le nostre precedenti revisioni del protocollo27,28 su quell’approccio sperimentale. Inoltre, come prova di concetto, forniamo linee guida riguardanti la calibrazione della configurazione, la preparazione delle cellule, l’acquisizione dei dati e l’analisi per l’istituzione della legge di diffusione svFCS (DL) per Thy1-GFP, una proteina ancorata al glicosilfosfatidilinositolo della membrana plasmatica, che è nota per essere localizzata nei nanodomini della zattera lipidica29. Infine, dimostriamo come la parziale destabilizzazione dei nanodomini lipidici da parte del trattamento con colesterolo ossidasi influisca sulle proprietà di diffusione di Thy1-GFP. Inoltre, una descrizione dettagliata della costruzione di una configurazione svFCS da zero è fornita in Materiale supplementare.

Protocol

1. Impostazione delle specifiche per l’assemblaggio di una configurazione svFCS personalizzata NOTA: la semplicità della configurazione svFCS proposta consente una facile installazione, funzionamento e manutenzione a basso costo, garantendo al contempo l’efficienza nel recupero dei fotoni. Per maggiori dettagli, vedere Materiale supplementare. Sala sperimentale e sicurezza Installare il sistema in una stanza stabilizzata a circa 21 °C. Evitare il flusso d’aria diretto sul tavolo ottico passivo (o attivo) e seguire le regole di sicurezza laser per l’allineamento ottico. Hardware e softwareNOTA: il materiale supplementare descrive in dettaglio le fasi di installazione illustrate nella Figura 2. Scrivi il software di acquisizione e controllo principale in LabVIEW utilizzando una macchina a stati e un’architettura della struttura degli eventi in cui una scheda di acquisizione multifunzione guida la maggior parte dei controller.NOTA: il correlatore, il laser e il misuratore di potenza sono controllati o monitorati dal proprio software. Adattare le procedure di installazione hardware e software in base all’hardware utilizzato. Configurazione otticaNOTA: la Figura 3 illustra i moduli da banco ottici utilizzati nelle sezioni seguenti per controllare la qualità degli allineamenti ottici. Tutte le specifiche degli elementi ottici sono elencate nella Tabella dei materiali. La procedura per costruire l’installazione è ampiamente dettagliata in Materiale supplementare. Questo sistema comprende un laser a onda continua, un microscopio invertito motorizzato dotato di un obiettivo ad acqua ad immersione, un rilevatore di fotodiodi a valanga accoppiato a un singolo modulo di conteggio dei fotoni e un correlatore hardware. Una camera di incubazione al microscopio con riscaldatori privi di vibrazioni è stata appositamente progettata per controllare la temperatura per esperimenti su cellule viventi. Per convenzione, l’asse XY corrisponde al piano perpendicolare del percorso ottico e l’asse Z corrisponde al percorso ottico. 2. Checkpoint giornaliero prima di eseguire l’esperimento Controllare il percorso di eccitazione (Figura 3, & ). Aprire tutti i diaframmi dell’iride. Misurare la potenza del laser con il misuratore di potenza, mantenendo il primo diaframma completamente aperto. Ruotare la piastra a mezza onda (HWP) per trovare la potenza massima. Controllare l’allineamento utilizzando i iris se la potenza del laser è inferiore al solito e spostare L1 e M1 alternativamente, se necessario. Prendere nota del valore di potenza nel blocco appunti del laboratorio dell’esperimento. Controllare il percorso di rilevamento (Figura 3, & ). Posizionare l’acqua, un coperchio e una goccia di una soluzione di rodamina 6G (Rh6G) da 2 nM sull’obiettivo. Se il segnale di fluorescenza (numero di conteggio sull’APD, registrato con il software LabVIEW) è inferiore al solito, rifare la soluzione Rh6G, controllare il posizionamento e il numero di coverslip sull’obiettivo o eliminare le bolle, se presenti. Se il segnale di fluorescenza è ancora inferiore al solito, posizionare il misuratore di potenza all’interno del percorso ottico per bloccare il fascio. Spegnere l’APD (di seguito, APD si riferisce all’APD e al modulo di conteggio dei singoli fotoni). Rimuovere il campione. Pulire e sostituire l’obiettivo con un bersaglio riflettente. Controllare il raggio laser sul bersaglio riflettente rimuovendo il misuratore di potenza dal percorso della luce. Assicurarsi che il raggio del bersaglio sia centrato e che la riflessione posteriore raggiunga il primo iride sulla linea (Figura 3). In caso contrario, regolare il posizionamento centrale con M2 o il riflesso posteriore con lo specchio dicroico. Se l’accoppiamento al microscopio è corretto, spingere indietro la lente dell’obiettivo, aggiungere una goccia d’acqua, un coperchio e una goccia di una soluzione Rh6G più concentrata (cioè 200 nM) e impostare una potenza laser inferiore rispetto alle misurazioni classiche (pochi μW). Accendere l’APD e ottimizzare l’allineamento APD e stenopeico, alternativamente, con le rispettive viti di regolazione XYZ durante il monitoraggio del segnale di intensità (software LabVIEW). Cambiare il coverslip e aggiungere una concentrazione inferiore di Rh6G (2 nM). Sposta il foro stenopeico lungo l’asse Z per trovare una posizione in cui il rapporto di luminosità molecolare aumenta e la vita è minima. Chiudere il diaframma fino a quando il segnale non scende: la dimensione del raggio laser raggiunge la dimensione dell’apertura posteriore dell’obiettivo (cioè la dimensione minima della vita, vedi Materiale supplementare). Avviare il software correlatore e registrare i dati (vedere la sezione 7 per la registrazione dei dati). Controllare l’ACF, che dovrebbe mostrare una bassa quantità di rumore, dare una piccola dimensione della vita e un alto tasso di conteggio per molecola al secondo (vedere la sezione 7 per l’analisi dei dati e la valutazione del girovita). 3. Considerazioni generali per la registrazione e l’analisi dei dati svFCS Registrare e analizzare i dati di fluorescenza seguendo questo schema generale (vedere le sezioni 7, 8 e 9): (1) registrazione della fluorescenza e generazione ACF (software correlatore), (2) scarto imprevisto dei dati, una media dei dati conservati, adattamento al modello appropriato (con software Igor Pro fatto in casa), (3) grafico della legge di diffusione (software MATLAB fatto in casa 1) e (4) confronto opzionale della legge di diffusione (software MATLAB fatto in casa 2). I diversi programmi software sono disponibili su richiesta.NOTA: il correlatore hardware ha un tempo di campionamento minimo di 12,5 ns (ovvero una frequenza di campionamento di 80 MHz). Fornisce una risoluzione temporale che è almeno 1.000 inferiore al tipico tempo di residenza di libera diffusione di piccole molecole in soluzione e 106 inferiore al tempo di diffusione delle proteine di membrana all’interno di un volume di osservazione confocale. 4. Coltura cellulare e trasfezione Semina le cellule Cos7 in vetro di copertura a 8 pozzetti con fondo di vetro borosilicato #1.0 ad una densità di 10.000 cellule / pozzo usando il Modified Eagle Medium (DMEM) completo di Dulbecco integrato con siero bovino fetale al 5%, penicillina (100 U / mL), streptomicina (100 U / mL) e L-glutammina (1 mM). Coltivare le cellule a 37 °C in un’atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2 per 24 ore. Rimuovere il terreno, aggiungere 300 μL del terreno di coltura fresco completo per pozzetto e preincubare le cellule per 30 minuti a 37 °C. Diluire 0,5 μg del DNA plasmidico che codifica per la proteina Thy-1 fuso con eGFP25 in 50 μL di DMEM senza siero. Vortice brevemente da mescolare. Diluire 1,5 μL del reagente di trasfezione del DNA in 50 μL di DMEM privo di siero e mescolare bene la soluzione. Aggiungere il reagente di trasfezione diluito direttamente nella soluzione di DNA preparata e mescolare immediatamente i composti. Incubare la miscela preparata per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 10 μL dei complessi combinati DNA/reagente di trasfezione a goccia sul mezzo in ciascun pozzetto e omogeneizzare ruotando delicatamente la piastra. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2 per 3 ore. Dopo l’incubazione, sostituire il mezzo contenente i complessi di reagenti DNA/trasfezione con 400 μL di DMEM fresco completo e coltivare le cellule per 16 ore prima dell’esperimento svFCS. 5. Preparazione delle celle per le misurazioni svFCS Rimuovere il supporto della lingua. Lavare delicatamente le cellule due o tre volte con tampone di soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hank privo di siero contenente Ca2+ e Mg2+ integrato con 10 mM (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico) (HEPES), pH 7,4 (HBSS/HEPES). Mantenere le celle nel buffer HBSS/HEPES durante tutte le acquisizioni svFCS. 6. Trattamento farmacologico Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule due o tre volte con HBSS senza siero integrato con 10 mM HEPES, pH 7,4 (HBSS/HEPES). Incubare le cellule con 1 U/mL di soluzione di colesterolo ossidasi (COasi) in tampone HBSS/HEPES per 1 ora a 37 °C. Rimuovere la soluzione e mantenere le celle in presenza di 0,1 U/mL di COasi nel buffer HBSS/HEPES durante l’esecuzione delle misurazioni svFCS. 7. Calibrazione delle dimensioni dello spot Preriscaldare la camera del microscopio a 37 °C. Preparare una soluzione standard da 2 nM di Rh6G mediante diluizione seriale. Far cadere 200 μL di soluzione Rh6G da 2 nM su un coperchio di vetro posto sull’obiettivo di immersione in acqua. Avviare tutto l’hardware e il software. Misurare e regolare la potenza del raggio laser di 488 nm a 300 μW. A seconda della luminosità e della fotostabilità della sonda fluorescente utilizzata, adattare questa potenza in base a (1) l’intensità di fluorescenza (sul software LabVIEW), che dovrebbe essere stabile, (2) la forma ACF (sul software correlatore), che dovrebbe avere una forma costante nel tempo, e (3) i parametri di adattamento che danno una piccola dimensione della vita e un alto tasso di conteggio per molecola (fotoni per molecola al secondo, in genere da poche decine a centinaia di fotoni per molecola al secondo).NOTA: L’ampiezza dell’ACF (chiamata G(0)) è inversamente proporzionale al numero della molecola (cioè alla concentrazione della sonda fluorescente). Per la calibrazione del girovita, questo è un buon parametro candidato per il controllo di qualità. Pertanto, G(0) dovrebbe essere simile per la stessa concentrazione di giorno in giorno in quanto collega il girovita e la concentrazione. Per le misurazioni delle celle, poiché FCS è più accurato per la bassa concentrazione, G(0) dovrebbe essere alto per la corretta estrazione del parametro. Impostare la porta del microscopio di illuminazione/rilevamento svFCS con il software LabVIEW. Accendere l’APD. Chiudi l’iride fino a quando il segnale scende verso il basso per ottenere la dimensione minima della vita o chiudila per una dimensione della vita più grande. Registrare diversi ACF di durata selezionata (vale a dire una corsa) per migliorare la riproducibilità statistica, in genere 10 cicli della durata di 20 s ciascuno con il software del correlatore. Spegnere l’APD. Utilizzare il software Igor Pro per controllare e scartare le corse con forti fluttuazioni dovute agli aggregati molecolari. Esegui questo passaggio manualmente: dovrebbe essere indipendente dall’utente dopo che gli utenti sono stati addestrati. Adatta la media degli ACF conservati con un modello di diffusione 3D. Estrarre dai parametri di fitting il tempo medio di diffusione e salvarlo in un file “.txt” (il formato del file è dettato dal software Igor Pro). Controllare il count-rate per molecola al secondo (un buon indicatore di performance) dividendo l’intensità media (estratta dalla traccia di fluorescenza) per il numero di molecole (estratte dall’ACF).NOTA: assicurarsi che questo valore sia alto e stabile di giorno in giorno per gli stessi parametri di acquisizione. Conoscendo il coefficiente di diffusione di Rh6G in soluzione acquosa a 37 °C (D) e (vedi 7.13), calcolare il girovita sperimentale ω in base a: . Applicare la procedura per ogni modifica del girovita necessaria per tracciare la legge di diffusione FCS e prima di qualsiasi nuova serie sperimentale di acquisizione dati svFCS. 8. Acquisizioni di dati svFCS su celle Misurare e regolare la potenza del fascio di 488 nm tra 2 e 4 μW. A seconda della luminosità e della fotostabilità della sonda fluorescente utilizzata, adattare questa potenza per consentire un elevato tasso di conteggio per molecola (in genere diverse migliaia di fotoni per molecola al secondo), mantenendo basso il fotosbiancamento (cioè una traccia di intensità stabile sul software LabVIEW). Equilibrare i campioni per 10 minuti a 37 °C prima di iniziare le misurazioni. Impostare il microscopio con illuminazione a epifluorescenza con il software LabVIEW. Scegliere una cella con una posizione appropriata della sonda fluorescente e un’intensità del segnale di fluorescenza (bassa).NOTA: minore è la fluorescenza, migliori sono le misurazioni FCS (vedere il passaggio 8.1). Impostare la porta del microscopio di illuminazione/rilevamento svFCS con il software LabVIEW. Accendere l’APD. Eseguire una scansione xy della cella selezionata con il software LabVIEW. Eseguire una z-scan e localizzare il punto confocale alla massima intensità di fluorescenza scegliendo la membrana plasmatica nella parte superiore e avviare l’acquisizione dei dati. Per massimizzare la separazione tra le due membrane, eseguire preferibilmente la scansione nell’area nucleare della cellula. Registra una serie di 20 tirature della durata di 5 s, ciascuna con il software correlatore.NOTA: assicurarsi che la durata di ogni esecuzione sia sufficientemente lunga da ottenere ACF con rumore ridotto. Le acquisizioni lunghe sono suscettibili di fotosbiancamento o variazioni sostanziali impreviste (ad esempio, aggregati). Adattare il numero di esecuzioni, la loro durata e il numero di serie ai campioni, ma assicurarsi che rimangano costanti all’interno della stessa mole di esperimenti per la riproducibilità. Spegnere l’APD. Scartare le esecuzioni impreviste con il software Igor Pro. Adatta l’ACF medio con un modello di diffusione 2D di 2 specie. Adattare questo modello al tipo di comportamento di diffusione della molecola bersaglio. Salvate i parametri di raccordo nel file precedente (vedere il passaggio 7.13). Eseguire da 10 a 15 serie di registrazioni su almeno 10 celle diverse e riprodurre i passaggi da 8.3 a 8.13. Verificare che il singolo file ottenuto contenga le informazioni sul girovita e i parametri di adattamento delle 10-15 registrazioni. Per stabilire una singola legge di diffusione, analizzare almeno quattro taglie di vita variabili tra 200 e 400 nm. Questo intervallo è definito dal limite ottico di diffrazione, ma dipende dall’obiettivo (apertura numerica) e dal laser (lunghezza d’onda).NOTA: Poiché la calibrazione del girovita non è assoluta e presenta un certo grado di incertezza, è stato costruito un software MATLAB28 dedicato che tiene conto dell’errore x e y (vale a dire ω2 e td) per adattarsi alla legge di diffusione. Avvia il software MATLAB 1 e seleziona una cartella contenente tutti i file “.txt” corrispondenti ad almeno quattro esperimenti di dimensioni della vita. Plot <td> versus <ω2>, cioè la legge di diffusione. Si possono estrarre due parametri principali: l’intercetta dell’asse y (t0) e il coefficiente di diffusione effettivo (Deff, inversamente proporzionale alla pendenza). 9. Leggi di diffusione di diverse condizioni sperimentali di confronto NOTA: Se necessario, riprodurre le sezioni 7 e 8 per diverse condizioni sperimentali. È stato sviluppato un software dedicato (software MATLAB 2) per determinare se queste leggi di diffusione sono simili o meno secondo i valori t0 eff28. Mette alla prova due ipotesi: i due valori sono diversi, oppure i due valori non sono diversi ad una soglia posta al di sopra di una probabilità di falso allarme (PFA). Un valore PFA arbitrario del 5% (T = 3,8) è considerato il limite superiore di significatività tra due parametri (t0 o Deff), indicando che esiste solo il 5% di possibilità che i due valori siano identici. Creare un file “.xls” contenente i valori caratteristici della legge di diffusione di ciascuna condizione per confrontare (ad esempio, un file contenente l’errore t0, t0 , Deff e Deff per le condizioni non trattate (NT) e trattate (COase) come una tabella). Avviare il software MATLAB 2. Seleziona il file “.xls”. Analizzare il grafico 2D codificato a colori generato, in cui i test statistici t0 e Deff devono essere tracciati rispettivamente sugli assi x e y (Figura 4). Più alto è T, maggiore è la differenza tra i valori confrontati. 10. Misurazioni della concentrazione di colesterolo Trattamento cellulare e lisi Seminare le cellule Cos7 in triplice copia in piastre a 6 pozzetti a 4 × 105 cellule/pozzetto e incubare in 2 ml di DMEM completo a 37 °C con il 5% di CO2 durante la notte per consentire alle cellule di attaccarsi alla piastra. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aggiungere 1 mL di tampone HBSS/HEPES contenente (o meno, per i controlli) 1 U/mL di Coasi e incubare per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2. Sostituire il mezzo con 1 mL di HBSS/HEPES contenente 0,1 U/mL di Coasi e incubare per 1 ora a 37 °C con il 5% di CO2. Rimuovere la soluzione e raccogliere le cellule. Lavare le celle tre volte con PBS e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Lisare le cellule con tampone di saggio di radioimmunoprecipitazione (25 mM HEPES, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10 mM, MgCl2, 1 mM di acido tetraacetico etilendiammina, 2% di glicerolo, proteasi e cocktail inibitore della fosfatasi) per 30 minuti sul ghiaccio. Centrifugare i lisati a 10000 × g per 10 min a 4 °C e raccogliere il surnatante. Quantificare la concentrazione totale di proteine per ciascun campione mediante il test proteico di Bradford modificato utilizzando la soluzione di lavoro in base alle raccomandazioni del produttore. Misurazione della concentrazione di colesterolo Per determinare il livello di colesterolo cellulare totale enzimaticamente, utilizzare il kit appropriato (ad esempio, Amplex Red Cholesterol Assay Kit) secondo le raccomandazioni del produttore. Per ogni reazione, mescolare il campione contenente 5 μg di proteine con la soluzione di lavoro reagente Amplex Red/perossidasi di rafano/colesterolo ossidasi/colesterolo esterasi e incubare per 30 minuti a 37 °C al buio. Misurare la fluorescenza utilizzando l’eccitazione di 520 nm e rilevare l’emissione a 560-590 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Sottrarre lo sfondo dal valore finale e determinare la concentrazione di colesterolo utilizzando una curva standard. Calcola il contenuto finale di colesterolo in ng di colesterolo per μg di proteine.

Representative Results

Abbiamo generato un DL per Thy1-GFP espresso in celle Cos-7 (Figura 4, quadrati neri). La legge di diffusione ha un valore t 0 positivo (19,47 ms ± 2 ms), indicando che Thy1-GFP è confinato in strutture nanodominio della membrana plasmatica. Il trattamento con colesterolo ossidasi delle cellule che esprimono Thy1-GFP ha comportato lo spostamento del valore DL t0 a 7,36 ± 1,34 ms (Figura 4, quadrati grigi). Questa osservazione conferma che la natura del confinamento Thy1-GFP dipende dal contenuto di colesterolo ed è associata a nanodomini di zattera lipidica. Queste due leggi di diffusione si sono dimostrate diverse secondo il test statistico sopra descritto (vedi punto 9.1.3) in termini di valori t0 e Deff. Inoltre, abbiamo valutato la concentrazione di colesterolo cellulare totale nelle cellule Cos-7 non trattate rispetto alle cellule trattate con COase. Una piccola, ma significativa, diminuzione del contenuto di colesterolo totale è osservata durante il trattamento con COase (Figura 5). Poiché questo enzima agisce solo sul pool di colesterolo accessibile al foglietto esterno della membrana plasmatica, assumiamo che la diminuzione osservata del colesterolo sia associata solo alla membrana plasmatica e si traduca nella destabilizzazione dei nanodomini della zattera lipidica. Figura 1: Leggi di diffusione della spettroscopia di correlazione di fluorescenza simulata (FCS) stabilite da FCS a variazione spot per diverse forme di organizzazione della membrana. (Pannelli superiori) Rappresentazione schematica dell’organizzazione della membrana – (A) diffusione libera, (B) barriere a rete e (C) confinamenti trappola / dominio – con la traiettoria disegnata per una singola molecola (rosso). I cerchi blu denotano l’intersezione della membrana e del raggio laser della vita ω. (Pannelli inferiori) Leggi di diffusione FCS rappresentate tracciando il tempo di diffusione td in funzione del raggio quadrato ω2. La proiezione della legge di diffusione (linea tratteggiata verde) intercetta l’asse temporale a (A) l’origine (t0 = 0) nel caso di diffusione libera; (B) in asse negativo (t0 < 0) quando ci sono barriere a maglie, o (C) in asse positivo (t0 > 0) quando ci sono trappole e domini (zattere lipidiche). D è il coefficiente di diffusione laterale per il moto browniano; Deff, il coefficiente di diffusione effettivo; Dmicro, il coefficiente di diffusione microscopico all’interno delle trappole a maglie; Din, il coefficiente di diffusione all’interno dei domini; Dout, il coefficiente di diffusione al di fuori dei domini; L, la dimensione del lato di un dominio quadrato; e rD, il raggio di un dominio circolare. Questa figura è stata modificata da He e Marguet6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Visualizzazione schematica del controllo hardware svFCS. Il computer controlla tutti i dispositivi attraverso diversi protocolli di comunicazione: seriale (microscopio, otturatore esterno), USB (stadio piezoelettrico XYZ, correlatore) e PCI (scheda di acquisizione). DAQ: scheda di acquisizione dati, APD: fotodiodo a valanga, SPCM: modulo di conteggio a singolo fotone, DO: uscita digitale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Vista schematica dei percorsi ottici di eccitazione ed emissione della configurazione svFCS. La configurazione svFCS contiene quattro moduli: (1) l’uscita di un laser a fibra da 488 nm è collimata, (2) una combinazione di una piastra a mezza onda e di uno splitter a fascio polarizzante imposta la potenza ottica, (3) il raggio laser focalizzato sul campione dopo aver viaggiato attraverso un microscopio motorizzato privo di lenti tubolari e (4) la fluorescenza viene rilevata attraverso un percorso di rilevamento simile a quello confocale su un fotodiodo a valanga accoppiato a un singolo modulo di conteggio dei fotoni, che fornisce un segnale a un correlatore hardware. La semplicità conferisce al sistema sensibilità, robustezza e facilità d’uso (ampiamente commentata nel materiale supplementare). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Le leggi di diffusione svFCS generate dall’analisi di diffusione di Thy1-GFP espresse in Cos-7. leggi di diffusione svFCS delle cellule Cos-7 senza trattamento (NT, quadrati neri) e dopo trattamento con colesterolo ossidasi (COasi, cerchi grigi). L’inserto nel grafico rappresenta la verifica statistica di una differenza significativa tra le due leggi di diffusione svFCS presentate (secondo Mailfert et al.28). Il valore di prova (T) deve essere superiore alla soglia impostata a 3,8 quando entrambe le leggi di diffusione sono diverse. Più è alto, maggiore è la differenza tra le leggi di diffusione. Il valore di T è codificato a colori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Confronto del contenuto di colesterolo totale nelle cellule Cos-7. Le cellule Cos-7 sono state non trattate (NT) o trattate con 1 U / mL di colesterolo ossidasi (COasi) per 1 ora. I dati rappresentano un esempio di un esperimento in triplice copia. Un t-test a due code e spaiato è stato utilizzato per valutare la differenza statistica (α = 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella dei materiali: Elenco degli elementi ottici necessari per la configurazione svFCS. Materiale supplementare: Questo documento descrive la creazione di una configurazione svFCS da zero. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Qui abbiamo descritto l’implementazione del modulo svFCS su un microscopio fluorescente standard, un potente approccio sperimentale per decifrare la dinamica dell’organizzazione della membrana plasmatica nelle cellule viventi grazie all’analisi della legge di diffusione FCS. Concettualmente, lo svFCS si basa su un principio semplice: misure di correlazione della fluorescenza nel dominio del tempo variando le dimensioni dell’area di illuminazione23. Questa strategia è stata determinante nel dedurre informazioni nanoscopiche da misurazioni microscopiche, che aiutano a decifrare i principali elementi fisico-chimici che contribuiscono all’organizzazione della membrana plasmatica in stato stazionario25 e processi fisiologici 30,31,32,33. Complessivamente, queste analisi svFCS dimostrano inequivocabilmente l’esistenza di nanodomini lipidi-dipendenti in vari tipi di cellule e la loro implicazione diretta nella sintonizzazione di diversi eventi di segnalazione.

All’interno di questo quadro, ci sono alcuni aspetti ottici che devono essere considerati durante la costruzione della configurazione svFCS per ottimizzare il budget dei fotoni e ridurre al minimo le aberrazioni ottiche. Pertanto, si consiglia di utilizzare un microscopio da cui è possibile rimuovere la lente del tubo quando viene eseguita la misurazione svFCS. Inoltre, un singolo diaframma gioca un ruolo chiave nella configurazione svFCS: cambia la dimensione del fascio all’apertura posteriore dell’obiettivo, variando così direttamente la dimensione effettiva della vita (cioè il volume di eccitazione effettivo). Il diametro del fascio dovrebbe adattarsi alla pupilla posteriore dell’obiettivo per ottenere la più piccola dimensione della vita34. Questa opzione, che aiuta a regolare il girovita, garantisce l’ottimizzazione del budget dei fotoni ed è facile da implementare. Infine, un numero minimo di parti ottiche viene utilizzato lungo il percorso della luce; meno complesso è il sistema, meno fotoni si perdono. Tutte queste opzioni migliorano significativamente la robustezza degli esperimenti svFCS.

Per quanto riguarda il protocollo stesso, devono essere considerati alcuni passaggi critici. Il più importante è un allineamento appropriato dei percorsi ottici che è cruciale per il successo delle misurazioni svFCS (protocollo, sezione 2). Questo è facile da controllare analizzando il segnale di fluorescenza da una soluzione Rh6G da 2 nM, che dovrebbe essere ~ 200 kHz sotto l’illuminazione laser di 300 μW. Tutte le iridi devono essere aperte e gli ACF devono avere un’ampiezza importante (in genere G0 ~ 1,5-2,0). Un altro punto critico riguarda le cellule e la loro preparazione per l’analisi svFCS (protocollo, sezioni 4-8). La loro densità deve essere adattata in modo che le cellule isolate da osservare siano disponibili per l’analisi. Le cellule non aderenti devono essere immobilizzate su un vetro di copertura camerato utilizzando una soluzione di poli-L-lisina. Il segnale di fluorescenza dall’etichettatura delle celle non dovrebbe essere troppo forte, o si tradurrà in ACF molto piatti che sono difficili da adattare e i parametri di adattamento sono gravati da un errore importante. Inoltre, l’etichettatura non omogenea e gli aggregati di fluorescenza nelle cellule rendono le misurazioni svFCS estremamente difficili da interpretare. Infine, il trattamento con colesterolo ossidasi influisce sulla vitalità cellulare e l’analisi svFCS non deve superare un’ora dopo il trattamento. È anche meglio registrare le fluttuazioni di fluorescenza dalla membrana plasmatica superiore in quanto non è attaccata al supporto e non vi è alcun rischio di diffusione ostacolata delle molecole a causa delle interazioni fisiche con il supporto.

Ci sono stati abbastanza progressi nella tecnica svFCS per il suo uso in diversi approcci a causa della diversità delle modalità per regolare il volume di rilevamento, rendendo possibile studiare vari processi biologici nelle cellule viventi. Un’alternativa alla regolazione della dimensione del volume di eccitazione consiste nell’utilizzare un espansore a fascio variabile35. È anche possibile modulare semplicemente la dimensione dell’area di illuminazione registrando il segnale fluorescente dall’intercettazione della membrana plasmatica lungo la direzione z36. Questo può essere fatto su un microscopio confocale standard per il quale è stato sviluppato un quadro teorico per derivare la legge di diffusione37,38.

Sebbene il metodo svFCS offra una risoluzione spazio-temporale, necessaria per la caratterizzazione dell’organizzazione laterale disomogenea della membrana plasmatica, le modalità geometriche di confinamento non si escludono a vicenda. Una deviazione di t0 in una direzione o nell’altra rivela esclusivamente un modo dominante di confinamento25. Inoltre, un’altra importante limitazione dell’attuale metodo svFCS deriva dal classico limite di diffrazione ottica (~200 nm). Questo è indiscutibilmente maggiore dei domini che confinano le molecole all’interno della membrana plasmatica cellulare. Pertanto, l’analisi del confinamento è dedotta dal valore t0 , estrapolato dalla legge di diffusione.

Questo inconveniente è stato superato implementando metodi alternativi. Inizialmente, l’uso di pellicole metalliche perforate con nanoaperture offriva la possibilità di illuminare un’area di membrana molto piccola (cioè al di sotto del limite di diffrazione ottica di singole aperture nanometriche di raggi variabili tra 75 e 250 nm)39. È stato così riportato il regime di transizione previsto dalla legge teorica di diffusione per l’organizzazione di domini isolati, che ha permesso un affinamento della dimensione caratteristica delle eterogeneità nanometriche della membrana e una stima quantitativa della superficie occupata dai nanodomini lipido-dipendenti39. In alternativa, l’illuminazione nanometrica è stata sviluppata anche utilizzando la microscopia ottica a scansione a campo vicino40 o nanoantenne ottiche planari41. Più recentemente, la combinazione di esaurimento delle emissioni stimolate (STED) e FCS ha fornito uno strumento potente e sensibile per documentare la legge di diffusione con una risoluzione spaziale molto elevata. Questo STED-FCS dà accesso alle caratteristiche di diffusione molecolare su scala nanometrica che si verificano in un breve periodo di tempo, consentendo lo studio dell’organizzazione dinamica delle sonde lipidiche sulla membranaplasmatica 42,43. Tuttavia, la soppressione incompleta della fluorescenza nel processo STED sfida l’analisi delle curve di auto-correlazione in FCS.

È stato sviluppato un nuovo modello di fitting per superare questa difficoltà, migliorando l’accuratezza dei tempi di diffusione e le misure medie del numero di molecole44. Infine, per una lenta diffusione molecolare sulla membrana plasmatica, il principio svFCS può essere applicato ai dati registrati mediante spettroscopia di correlazione delle immagini45. Recentemente, è stato dimostrato che la combinazione della microscopia a forza atomica (AFM) con l’imaging a riflessione interna totale-FCS (ITIR-FCS) contribuisce al perfezionamento della natura del meccanismo che ostacola la diffusione molecolare sulla membrana plasmatica, specialmente vicino alla configurazione della membrana di soglia di percolazione a causa di un’alta densità di nanodomini46.

In conclusione, stabilire la legge di diffusione mediante svFCS ha fornito le prove sperimentali per dedurre l’eterogeneità locale creata da lipidi collettivi dinamici e associazioni di proteine di membrana. Come affermato da Wohland e colleghi46, “l’analisi della legge di diffusione FCS rimane uno strumento prezioso per dedurre caratteristiche strutturali e organizzative al di sotto del limite di risoluzione dalle informazioni dinamiche”. Tuttavia, abbiamo bisogno di sviluppare nuovi modelli per perfezionare l’interpretazione della legge di diffusione che dovrebbe consentire una migliore comprensione della dinamica degli eventi molecolari che si verificano sulla membrana plasmatica.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SB, SM e DM sono stati sostenuti da finanziamenti istituzionali del CNRS, dell’Inserm e dell’Università di Aix-Marseille e da sovvenzioni di programma dell’Agenzia nazionale francese per la ricerca (ANR-17-CE15-0032-01 e ANR-18-CE15-0021-02) e dell'”Investissement d’Avenir” francese (ANR-10-INBS-04 France-BioImaging, ANR-11-LABX-054 labex INFORM). KW riconosce “BioTechNan”, un programma di studi di dottorato ambientale interdisciplinare KNOW nel campo delle biotecnologie e delle nanotecnologie. EB riconosce il sostegno finanziario del National Science Centre of Poland (NCN) nell’ambito del progetto n. 2016/21/D/NZ1/00285, nonché del governo francese e dell’Ambasciata di Francia in Polonia. MŁ riconosce il sostegno finanziario del Ministero dello Sviluppo polacco (CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19) e del Centro nazionale per la ricerca e lo sviluppo (Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17). TT riconosce il sostegno finanziario del National Science Center of Poland (NCN) nell’ambito del progetto n. 2016/21/B/NZ3/00343 e del Wroclaw Biotechnology Center (KNOW).

Materials

Aligment tool Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings Thorlabs SPW602
Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM) Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode Excelitas SPCM-AQRH-15
BNC 50 Ω plug to 50 Ω plug lead 2 m RS Components 742-4315
Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 Ω With connector, 1.22 m, RoHS2 RS Components 885-8172
Tee 50Ω RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 → 1GHz RS Components 546-4948
Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E – French Extension Lead, 230 V RS Components 768-5500
Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C RS Components 452-8394
Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter RS Components 792-4079
Fluorescence filtering 535/70 ET Bandpass, AOI 0° Chroma Diameter 25 mm AHF filter F47-539
Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45° Chroma 25.5 x 36 x 1 mm AHF filter F43-088
496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0° Chroma Diameter 25 AHF filter F37-496
Hardware correlator 80 MHz Digital Correlator Correlator.com Flex02-12D
Laser LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW Lasos BLD-XT 488100
Laser safety High-Performance Black Masking Tape, 1" x 180' (25 mm x 55 m) Roll Thorlabs T743-2.0
Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets Thorlabs MC-5
Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission Thorlabs LG3B
Microscope Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope
Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters		 Carl Zeiss
C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS
(D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR		 Carl Zeiss 421767-9971-711
Adapter W0.8 / M27x0.75 H "5" Carl Zeiss 000000-1698-345
Middle ring W0.8 – W0.8 H "5" Carl Zeiss 000000-1698-347
Optical path D25.4mm Mirror, Protected Silver Thorlabs PF10-03-P01
D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat Thorlabs AC254-060-A
D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat Thorlabs AC254-035-A
25 µm mounted pinhole Thorlabs P25S I
25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm Thorlabs WPH10M-488 (HWP)
20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm Thorlabs PBS201
Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID Thorlabs RSP1/M
52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount Thorlabs KM100B/M
Adjustable Prism Clamp Thorlabs PM3/M
Beam block – active area 19 mm x 38 mm Thorlabs LB1/M
Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture Thorlabs ID25/M
Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount Thorlabs KM100CL
1" Optic Holder, M4 Tap Thorlabs MFF101/M
1" Stackable Lens Tube Thorlabs SM1L03
Stackable Lens Mount for 1" optic-usable depth ½ Thorlabs SM1L05
Stackable Lens Mount For 1"Optic-usable Depth 2" Thorlabs SM1L20
Small Optical Rails 600mm, metric Thorlabs RLA600/M
Small Optical Rails 75mm, metric Thorlabs RLA075/M
Small Optical Rails 150mm, metric Thorlabs RLA150/M
Rail Carrier, Counterbored Hole 1"x 1" Thorlabs RC1
Rail Carrier, Perpendicular Dovetail Thorlabs RC3
High Precision Translating Lens Mount for 1 inch Thorlabs LM1XY/M
½ " (12mm) Dovetail Translation Stage Thorlabs DT12/M
Rail Clamps Thorlabs CL6
Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102) Thorlabs PT3/M
Black Rubberized Fabric Thorlabs BK5
Ball Driver kit/ 6 tools Thorlabs BD-KIT/M
Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads Thorlabs AP6M4M
Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack Thorlabs BA1S/M-P5
Lens Mount for 25.4mm optic Thorlabs LMR1/M
SM1 FC/APC Adapter Thorlabs SM1FCA
Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics Thorlabs KM100
Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW Thorlabs S120C
12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew,
L=50 mm, 5 Pack		 Thorlabs PH50/M-P5
Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm Thorlabs PH20/M
12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole, 5 Pack		 Thorlabs TR50/M-P5
12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole, 5 Pack		 Thorlabs TR75/M-P5
USB Power and Energy Meter Interface Thorlabs PM100USB
12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole		 Thorlabs TR30/M
12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,
M6-Tapped Hole		 Thorlabs TR20/M
750 mm long Structural Rail (detection box) Thorlabs XE25L750/M
350 mm long Structural Rail (detection box) Thorlabs XE25L350/M
Quick Corner Cube for 25 mm Rails Thorlabs XE25W3
Right-Angle Bracket for 25 mm Rails Thorlabs XE25A90
Black posterboard 20" x 30" (508 mm x 762 mm), 1/16" (1.6 mm) Thick, 5 Sheets Thorlabs TB5
Hinge for 25 mm Rail Enclosures Thorlabs XE25H
Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures Thorlabs XE25LS
M4 Cap Screw Kit Thorlabs HW-KIT1/M
M6 Cap Screw Kit and Hardware kit Thorlabs HW-KIT2/M
Table Clamp, L-Shape, 5 Pack Thorlabs CL5-P5
SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (Ø0.8 – Ø12 mm) Thorlabs SM1D12D
Ø1" SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/Ø1 mm Hole Thorlabs DG10-1500-H1-MD
Honeycomb Optical Table Top, Standa Standa 1HB10-15-12
Optical Table support, Standa Standa 1TS05-12-06-AR
Sample nano-positionning Precision XYZ Nanopositioning Physik Instrumente PI P527-3.CD
Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V
Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,		 Physik Instrumente PI E727-3.CD
Temperature chamber Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK Digital Pixel
Dual Channel Microprocessor Temperature Controller Digital Pixel DP_MTC_2000_DUO
Two Vibration Free Heater Modules Digital Pixel DP_150_VF
PT100 Temperature Sensor Digital Pixel DP_P100_TS
Biological Reagents and Materials
Cell culture and transfection Cos7 cells ATCC® CRL-1651™
8- well Lab-Tek chambers Thermo Fisher Scientific 155411PK
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific 16000044
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
PBS buffer Thermo Fisher Scientific 14190144
PenStrep Thermo Fisher Scientific 15140122
PolyJet Transfection Reagent SignaGen Laboratories SL100688
Cholesterol content measurement Amplex Red Cholesterol Assay Kit Thermo Fisher Scientific A12216
Protease Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 87786
Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78420
ROTI Nanoquant Working Solution Roth K880
GloMax Discover Microplate Reader Promega GM3000
svFCS measurements HBSS buffer Thermo Fisher Scientific 14025092
Hepes buffer Thermo Fisher Scientific 15630080
Cholesterol oxidase Sigma-Aldrich C8868
Rhodamine 6G Sigma-Aldrich 83697-1G
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Mailfert, S., Wojtowicz, K., Brustlein, S., Blaszczak, E., Bertaux, N., Łukaszewicz, M., Marguet, D., Trombik, T. Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells. J. Vis. Exp. (165), e61823, doi:10.3791/61823 (2020).
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