ノンコード低分子RNA MicCは、 サルモネラ ・エンテリティディスの外膜タンパク質の病原性に寄与します
Summary
λ-Red媒介組換え系を用いて、小さなノンコーディングRNA micCの欠失変異体を作製した。
Abstract
ノンコーディング低分子RNA(sRNA)は、転写後レベルで遺伝子発現を制御する新しい因子です。大腸菌やネズミチフス菌で知られている一種のsRNA MicCは、外膜タンパク質の発現を抑制する可能性があります。サルモネラ・エンテリティディスにおけるmicCの制御機能をさらに調べるために、サルモネラ・エンテリティディス50336株のmicC遺伝子をクローニングし、λRedベースの組換えシステムによって変異体50336Δ micCを構築し、miccを発現する組換えプラスミドpBR322を保有する相補変異体50336ΔmicC/p micCを構築しました。 qRT-PCRの結果、50336Δ micCにおけるompDの転写は野生株のそれより1.3倍高く、50336ΔmicCにおけるompAおよびompCの転写は野生株のそれより2.2倍および3倍高いことが示された。 これらは、micCがompAおよびompCの発現を抑制することを示した。以下の研究では、50336ΔmicCの病原性は、6週齢のBalb / cマウスと1日齢のニワトリの両方に感染することによって検出されました。その結果、6週齢のBalb/cマウスの野生株50336のLD50、変異株50336ΔmicCおよび50336Δ micC/pmicCは、それぞれ12.59 CFU、5.01 CFU、および19.95 CFUであることが示された。1日齢ニワトリのLD50株は,それぞれ1.13 x 109 CFU,1.55 x 10 8 CFU,2.54 x 108 CFUであった。micCの欠失がSの病原性を亢進させることを示した。 外膜タンパク質の発現を調節することにより、マウスおよびニワトリにおける腸炎。
Introduction
ノンコード低分子RNA(sRNA)は40〜400ヌクレオチド長であり、一般にタンパク質をコードしないが、細菌染色体1,2,3で独立して転写することができる。ほとんどのsRNAは、遺伝子コード領域間の遺伝子間領域(IGR)にコードされており、塩基対形成作用を介して標的mRNAと相互作用し、転写後レベルで標的遺伝子の発現を調節しています4,5。それらは、物質代謝、外膜タンパク質合成、クォーラムセンシング、および病原性遺伝子発現において重要な調節的役割を果たします5。
MicCは、大腸菌およびサルモネラ・エンテリカ・セロバー・チフィムリウムに存在する109ヌクレオチドの低分子RNA転写産物であり、OmpC、OmpD、OmpN、Omp35およびOmp36 6,7,8,9などの複数の外膜タンパク質発現を調節することができる。MicCは、in vitroでompC mRNAリーダーへのリボソーム結合を阻害することによってOmpCの発現を調節し、大腸菌での機能のためにHfq RNAシャペロンを必要とします6。ネズミチフス菌では、MicCはコード配列(コドン23〜26)内の≤12 bp RNA二重鎖を介してompD mRNAをサイレンシングし、エンドヌクレアーゼmRNA7を不安定にします。この調節プロセスは、シャペロンタンパク質Hfq10によって支援される。OmpCは豊富な外膜タンパク質であり、腸管など栄養・毒素濃度が高い環境では重要であると考えられていました6。OmpDポリンは、ネズミチフス菌の中で最も豊富な外膜タンパク質であり、全細胞タンパク質の約1%を占めています11。OmpDは、ヒトマクロファージおよび腸上皮細胞への接着に関与する12。MicCはまた、OmpCおよびOmpDポリンの両方の発現を抑制する。MicCは病原性を調節すると考えられています。MicCによって制御される新しい標的遺伝子を探索し、micCの病原性制御機能を研究するために、サルモネラ・エンテリティディス(SE)株50336のmicC遺伝子をクローニングし、変異体50336ΔmicCと相補変異体50336ΔmicC/pmicCを構築しました。新規標的遺伝子をqRT-PCRによりスクリーニングした。50336ΔmicCの病原性は、マウスおよびニワトリ感染によって検出された。
Protocol
Representative Results
Discussion
S. 腸炎は、若いニワトリに感染する可能性があり、腸炎から全身感染および死亡までの症状を引き起こす重要な通性細胞内病原体です17,18。さらに、S. enteritidisは成鶏に潜伏感染を引き起こし、慢性保菌者は家禽製品を汚染し、ヒトに食品媒介感染症を引き起こします19。S. Enteritidisの病原性メカニズムは、まだ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、中国国家科学基金会(第31972651号、第31101826号)、江蘇省高等教育科学基金会(第14号KJB230002号)、獣医バイオテクノロジー国家重点研究所(第SKLVBF201509号)、揚州自然科学財団助成金(第YZ2014019号)、江蘇省高等教育機関(PAPD)の優先学術プログラム開発プロジェクトからの助成金によって支援されました。
Materials
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
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