يساهم ميكروفون الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر في الفوعة في بروتينات الغشاء الخارجي في السالمونيلا المعوية
Summary
تم استخدام نظام إعادة التركيب بوساطة λ-Red لإنشاء متحولة حذف لميكروفون RNA صغير غير مشفر.
Abstract
يعد الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sRNA) عاملا جديدا لتنظيم التعبير الجيني على مستوى ما بعد النسخ. يمكن لنوع من sRNA MicC ، المعروف في الإشريكية القولونية والسالمونيلا التيفيموريوم ، قمع التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي. لمزيد من التحقيق في وظيفة تنظيم micC في Salmonella Enteritidis ، قمنا باستنساخ جين micC في سلالة Salmonella Enteritidis 50336 ، ثم قمنا ببناء micC المتحور 50336Δ بواسطة نظام إعادة التركيب القائم على λ Red والطافر المكمل 50336Δ micC / p micC الذي يحمل البلازميد المؤتلف pBR322 الذي يعبر عن micC. أظهرت نتائج qRT-PCR أن نسخ ompD في 50336Δ micC كان أعلى بمقدار 1.3 مرة من ذلك في سلالة النوع البري ، في حين أن نسخ ompA و ompC في 50336ΔmicC كان أعلى بمقدار 2.2 ضعف و 3 أضعاف من تلك الموجودة في سلالة النوع البري. أشارت هذه إلى أن micC يقمع تعبير ompA و ompC. في الدراسة التالية ، تم الكشف عن إمراضية 50336ΔmicC من قبل كل من الفئران المصابة Balb / c البالغة من العمر 6 أسابيع والدجاج البالغ من العمر 1 يوم. أظهرت النتائج أن LD 50 من سلالة النوع البري 50336 ، والطافرات 50336Δ micC و 50336Δ micC / pmicC للفئران Balb / c البالغة من العمر 6 أسابيع كانت 12.59 CFU و 5.01 CFU و 19.95 CFU على التوالي. كانت LD 50 من سلالات الدجاج البالغ من العمر يوما واحدا 1.13 × 109 CFU و 1.55 × 10 8 CFU و2.54 × 10 8 CFU ، على التوالي. وأشارت إلى أن حذف الميكروفون يعزز ضراوة S. Enteritidis في الفئران والدجاج عن طريق تنظيم التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي.
Introduction
يبلغ طول الحمض النووي الريبي الصغير غير المشفر (sRNAs) 40-400 نيوكليوتيدات ، والتي لا تشفر البروتينات بشكل عام ولكن يمكن نسخها بشكل مستقل في الكروموسومات البكتيرية1،2،3. يتم تشفير معظم sRNAs في المناطق بين الجينات (IGRs) بين مناطق ترميز الجينات وتتفاعل مع mRNAs المستهدفة من خلال إجراءات إقران القواعد ، وتنظم التعبير الجيني المستهدف على مستوى ما بعد النسخ 4,5. يلعبون أدوارا تنظيمية مهمة في استقلاب المواد ، وتخليق بروتين الغشاء الخارجي ، واستشعار النصاب ، والتعبير الجيني للفوعة5.
MicC عبارة عن نسخة صغيرة من الحمض النووي الريبي مكونة من 109 نيوكليوتيد موجودة في الإشريكية القولونية والسالمونيلا المعوية المصلية التيفيموريوم ، والتي يمكن أن تنظم تعبير بروتين الغشاء الخارجي المتعدد مثل OmpC و OmpD و OmpN و Omp35 و Omp366،7،8،9. ينظم MicC التعبير عن OmpC عن طريق تثبيط ارتباط الريبوسوم بزعيم ompC mRNA في المختبر ويتطلب مرافقة Hfq RNA لوظيفته في الإشريكية القولونية6. في السالمونيلا التيفيموريوم ، يسكت MicC ompD mRNA عبر ازدواج الحمض النووي الريبي ≤12-bp داخل تسلسل الترميز (الكودونات 23-26) ثم يزعزع استقرار mRNA7 داخل النوكلية. يتم مساعدة عملية التنظيم هذه بواسطة بروتين المرافق Hfq10. OmpC هو بروتين غشاء خارجي وفير كان يعتقد أنه مهم في البيئات التي كانت فيها تركيزات المغذيات والسموم عالية ، كما هو الحال في الأمعاء6. بورين OmpD هو بروتين الغشاء الخارجي الأكثر وفرة في السالمونيلا التيفيموريوم ويمثل حوالي 1 ٪ من إجمالي بروتين الخلية11. يشارك OmpD في الالتزام بالبلاعم البشرية والخلايا الظهارية المعوية12. يقوم MicC أيضا بقمع التعبير عن كل من OmpC و OmpD porins. ويعتقد أن MicC قد ينظم الفوعة. لاستكشاف الجينات المستهدفة الجديدة التي ينظمها MicC ودراسة وظيفة تنظيم الفوعة ل micC ، قمنا باستنساخ جين micC في سلالة Salmonella Enteritidis (SE) 50336 ، ثم قمنا ببناء الطافر 50336ΔmicC والطافر المكمل 50336ΔmicC / p micC. تم فحص الجينات المستهدفة الجديدة بواسطة qRT-PCR. تم الكشف عن ضراوة 50336ΔmicC من قبل الفئران والتهابات الدجاج.
Protocol
Representative Results
Discussion
س. Enteritidis هو أحد مسببات الأمراض الاختيارية المهمة داخل الخلايا التي يمكن أن تصيب الدجاج الصغير وتنتج أعراضا من التهاب الأمعاء إلى العدوى الجهازية والموت17,18. بالإضافة إلى ذلك ، تسبب S. Enteritidis التهابات كامنة في الدجاج البالغ والناقلات المزمنة تلوث من…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بمنح من مؤسسة العلوم الوطنية الصينية (رقم 31972651 و 31101826) ، ومؤسسة جيانغسو لعلوم التعليم العالي (رقم 14KJB230002) ، ومختبر الدولة الرئيسي للتكنولوجيا الحيوية البيطرية (رقم SKLVBF201509) ، ومنحة مؤسسة علوم الطبيعة في يانغتشو (رقم YZ2014019) ، وهو مشروع ممول من تطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (PAPD).
Materials
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
- Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
- Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
- Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
- Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
- Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
- Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
- Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
- Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
- Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
- Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
- Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
- Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
- Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
- Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
- De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
- Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
- Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
- Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
- Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
- Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
- Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
- Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
- Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).
