JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

Трансиллюминация-помощь рассечение конкретных этапов мыши seminiferous эпителиального цикла для downstream иммуностенсивных анализов

Published: October 07, 2020
doi:
10.3791/61800
, , , , , , , ,
1Institute of Biomedicine, Integrative Physiology and Pharmacology Unit,University of Turku, Turku, Finland, 2Department of Pediatrics,Turku University Hospital, Turku, Finland, 3Centre for Reproductive Health,Hudson Institute of Medical Research, Melbourne, VIC 3168, Australia, 4Australian Regenerative Medicine Institute,Monash University, Melbourne, VIC 3800, Australia

Summary

Этот протокол описывает трансиллюминации при содействии микроперепись сегментов взрослых мыши семенной трубочки, представляющие конкретные этапы семенной эпителиального цикла, и типы клеток в нем, и последующее иммуностеление сквош препаратов и нетронутых сегментов труб.

Abstract

Сперматогенез является уникальным процессом дифференциации, что в конечном итоге приводит к одному из самых различных типов клеток тела, спермы. Дифференциация зародышевых клеток происходит в цитоплазмических карманах соматических клеток Сертоли, которые одновременно принимают от 4 до 5 поколений зародышевых клеток и координируют и синхронизируют их развитие. Таким образом, состав типов зародышевых клеток в поперечном сечении является постоянным, и эти клеточные ассоциации также известны как этапы (I-XII) семенного эпителиального цикла. Важно отметить, что этапы могут быть также определены из нетронутых семенных трубок на основе их дифференциального поглощения света / рассеяния характеристики, выявленные трансилюминации, и тот факт, что этапы следуют друг за другом вдоль трубочки в численном порядке. В этой статье описывается метод микродиссекции с помощью трансиллюминации для изоляции семенных сегментов труб, представляющих конкретные этапы семенного эпителиального цикла мыши. Схема поглощения света семенных трубочки сначала проверяется под микроскопом вскрытия, а затем сегменты труб, представляющие конкретные этапы, вырезаются и используются для нисходящего применения. Здесь мы описываем иммуностимулирование протоколов для стадии конкретных препаратов сквош и для нетронутых сегментов труб. Этот метод позволяет исследователю сосредоточиться на биологических событиях, происходящих на определенных этапах сперматогенеза, обеспечивая тем самым уникальный инструмент для развития, токсикологических и цитологических исследований сперматогенеза и лежащих в основе молекулярных механизмов.

Introduction

Дифференциация мужских зародышевых клеток от диплоидной сперматогонии до зрелых гаплоидных сперматозоидов, т.е.сперматогенеза, является сложным процессом, который происходит в эпителии семенных трубочных трубок в яичках сексуально зрелогочеловека 1. Митотические потомки A1 сперматозоидов сначала разделить пять раз, чтобы расширить дифференциацию совершенных населения, а затем ввести мейоз, как сперматозоиды, которые в конечном итоге привести к гаплоидных сперматозоидов. Дифференциация круглых сперматозоидов на сперматозоиды, т.е.спермиогенез, включает в себя сложные изменения в клеточной морфологии, включая ядерную уплотнение и строительство сперматозоидов конкретных структур, таких как акросома и флагеллум. В мыши, весь процесс сперматогенеза занимает 35 дней, чтобы завершить2,3.

В любом месте, семенной эпителий хостов до пяти когорт дифференциации зародышевых клеток плюс зародышевой стволовых / прародителя клеток и соматических клетокСертоли 1. Дифференциация зародышевых клеток образуют концентрические слои, состав которых предсказуем, а гаплоидные клетки на данном этапе развития всегда ассоциируются с определенными типами сперматозоидов и сперматозоидов4,5. Поэтому в любом поперечном сечении трубоубийки находятся когорты зародышевых клеток постоянного состава. Эти специфические клеточные ассоциации определяются как стадии семенного эпителия. Этапы как таковые не представляют застойных контрольных точей, как государства, но постоянно развиваться, как дифференциация когорт зародышевыхклеток прогрессирует в синхронности 1,2,6. У мышей, Есть 12 этапов (I-XII)2, которые расположены в сегментной моды вдоль продольной оси семенной трубочки, и они следуют друг за другом в логическом порядке, таким образом образуя волну семенной эпителия, или сперматогеннойволны 7,8,9 (Рисунок 1). Завершение сперматогенеза занимает четыре цикла, а иерархические слои или когорты дифференциации зародышевых клеток в пределах любого семенного поперечного сечения трубочки являются временно одним семенным циклом отдельно друг от друга. Длина цикла зависит от вида и в мыши каждый цикл занимает 8,6 дней10.

Этапы можно определить на основе клеточного состава и организации семенного эпителия на гистологических секцияхяичка 5 (рисунок 1 и рисунок 2). Тем не менее, гистологический анализ является трудоемким, трудоемким и требует фиксации и окрашивания, и поэтому не может быть применен к живой ткани. Важно отметить, что постановка также может быть выполнена на живой ткани под микроскопом вскрытия, воспользовавшись различными схемами поглощения света/рассеяния, выставленными на различных стадиях цикла(рисунок 2). Способность каждого этапа поглощать и рассеивать свет относительно уровня хроматина конденсации поздних пост-мейотических сперматозоидов, что любой данной стадии хостов и упаковки этих клеток впучки 7,11. Дифференциация сперматозоидов, т.е.спермиогенез, далее делится на 16 этапов развития, включая 8 ступеней круглого сперматозоида (шаг 1-8) и 8 ступеней удлиненной сперматозоидов (шаги 9-16) дифференциации(рисунок 1). Шаг 9-11 удлинение сперматозоидов (этап IX-XI) отображать только низкий уровень конденсата хроматина в результате чего небольшое количество света поглощается. Конденсат хроматина начинается в шаге 11 сперматозоидов (этап XI), и шаг 15-16 удлиняющиеся сперматозоиды (этап IV-VIII) содержат полностью сгущенный хроматин, и поэтому обладают максимальным поглощением света(рисунок 3). Хроматин должен быть конденсирован для того, чтобы быть плотно упакованы в голову спермы. Дополнительными факторами, способствующими улучшению поглощения света, являются расположение удлиненных сперматозоидов в эпителии (базальный против апикал) и комплектация удлиненных сперматозоидов (произносится поэтапно II-V)11 (рисунок 3). Комплекты рассматриваются как пятна в середине трубоубивания и как полосы по краям под микроскопом вскрытия и более сжатый хроматин, тем темнее пятно / полоса11.

В этой статье описывается использование метода микродиссеции с помощью трансиллюминации для изоляции семенных сегментов труб, представляющих конкретные этапы семенного эпителиального цикла. После изоляции, постановочные сегменты трубчатых может быть предметом различных анализов вниз по течению, в том числе биохимических РНКи белковых анализов 12,13,14,15, потокцитометрии 16, ex vivo трубчатой культуры 17 и иммуностимулирования18. Здесь мы также предоставляем подробные протоколы вниз по течению для подготовки раздавленных монослой постановочных сегментов труб для живого клеточного морфологического анализа и последующего иммуностеинирования, а также цельно-монтажных иммуностементов сегментов труб. Рабочий процесс в двух словах, описанных на рисунке 4.

Метод микродиссекции с помощью трансиллюминации позволяет точно идентифицировать и изоляцию зародышевых клеток на определенных этапах дифференциации благодаря синхронизированному клеточному составу этапов. Важно отметить, что он также позволяет изучать сценические события во время сперматогенеза на живой ткани. Учитывая отсутствие масштабируемых моделей in vitro для сперматогенеза, этот метод также имеет уникальное преимущество, позволяя целевых краткосрочных исследований развития и токсикологических исследований на стадии конкретных сегментов трубоубий ex vivo12,17. Хотя мы описываем метод здесь для мыши, та же процедура может быть применена к любому виду млекопитающих с продольным и сегментальным расположением семенных эпителиальных стадий, таких каккрыса 4,7,15,19,20.

Protocol

Обслуживание лабораторных мышей и все эксперименты на животных проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами по уходу и использованию лабораторных животных в Университете Турку. 1. Приготовление семенных трубок для микропересасывания Пожертвуй взрослой мышонки (≥8 недель, яичка 80-120 мг в зависимости от деформации и возраста) через CO2 удушье с последующим вывихом шейки матки.ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь должна быть сексуально зрелой, и желательно, по крайней мере 8 недель. Трансиллюминация юных мышей отличается от взрослой, потому что волна семенного эпителия еще не полностью установлена, а сроки первой волны сперматогенезаотличаются 21,22. Отсутствие удлиняющих сперматозоидов у мышей-самцов, которым 4 недели, исключает их использование для микродиссекции с помощью трансиллюминации. Все штаммы мыши, которые имеют нормальный сперматогенез могут быть использованы. Спрей брюшной полости с 70% этанола. Откройте абдоминопо тазовой полости с помощью стерильных ножниц, что делает V-образное отверстие. Тяговая на эпидидимальной жировой площадке с стерильными типсами, найти яички, вскрыть их с помощью ножниц и поместить их на стерильные 100-мм чашки Петри, содержащие PBS.ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания стерильности убедитесь, что все лабораторные и хирургические инструменты стерильны. Использование тонкой наконечником ножницы decapsulate яички путем резки щели в туника albuginea, толстый волокнистый лист инкапсуляции яичка. Затем разорвать туника открыть с помощью пары типсов. Заставить трубоубий, нажав с типсами и отказаться от туники.ПРИМЕЧАНИЕ: При отказе от туники, это может быть полезно для некоторых приложений вниз по течению, что arteria testicularis удаляется вместе с туники. Избегайте повреждения семенных трубок. Переместите семенные трубочки в новую чашку Петри и налейте достаточно стерильных PBS, чтобы покрыть дно чашки Петри. Затем аккуратно потяните трубоушки друг от друга, но избегайте повреждения труб.ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком большой механический стресс будет посягать на трансиллюминации картины и влияют на жизнеспособность ткани и ее клеточной архитектуры. Трубочные трубы также могут быть обработаны для цельно-монтажных иммуностимулирований с этой точки без постановки (3B). Иногда достаточно определить стадию ретроспективно, включив антитела против белков, выраженных в дифференциации сперматозоидов, таких как SALL4, c-KIT и DNMT3A18,23. Плотность сперматозоидов является относительно надежным индикатором стадии(рисунок 2). 2. Микродиссеция с помощью трансиллюминации Поместите чашку Петри под микроскопом вскрытия твердо, лентой его на сцену.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы лента чашку Петри хорошо, чтобы предотвратить его движение, которое может привести к смешиванию собранных постановочных семенных сегментов трубочки. Чтобы выявить светопоглощение модели семенных трубок под фокусом, убедитесь, что образец освещается снизу и свет проходит через образец, т.е.он трансилмилируется.ПРИМЕЧАНИЕ: Количество света поглощается / рассеивается по отношению к уровню конденсата хроматина в удлиненные сперматозоиды и их комплектации внутри семенной трубочки: чем больше конденсированных, тем больше света поглощается, т.е.появляется темнее. Ознакомитесь с моделью поглощения света различных стадий, описанной на рисунке 2, рисунке 5A и рисунке S1, тщательно перемещая пучки труб труб с использованием тонких типсов.ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы всегда следуют друг за другом в логическом порядке, образуя волну семенного эпителия. Тем не менее, важно знать, что направление сперматогенной волны иногда меняется, а затем возвращается обратно (также известный как модуляции4,9), иногда усложняет процедуру. Кроме того, длина каждого этапа, с точки зрения того, сколько мм трубоубивания, значительно варьируется. Аккуратно поднимите трубоубийку, представляющие интерес, используя типсы с крючковатым кончиком, а затем вырежьте сегмент соответствующей длины с помощью ножниц микропереписьа (см. Дополнительное видео 1). Крючок на кончике типса облегчает подъем и удержание трубоубивания и помогает избежать его сжатия.ПРИМЕЧАНИЕ: Длина сегментов, которые будут сокращены, зависит от приложений ниже по течению. Для сбора бильярдных кусочков трубоубий определенной стадии для анализабелка или РНК 12,13 (II-V, VII-VIII и IX-XI, рисунок 5B)длинаобычносоставляет 2-5 мм. При использовании стандартной экстракции фенол-хлороформа, около 200 нг РНК может быть получено из 1 мм трубоубивания. Для цельного монтажа окрашивания постановочных сегментов трубчатых труб длина сегментов должна быть 5 мм. Для приготовления сквоша длина сегментов не должна превышать 1-2 мм, так как клетки в середине сегмента могут не выйти, если слишком долго. Используйте шкалу мм под чашкой Петри для точного измерения длины труб. 3. Иммуноумирование различных препаратов Подготовка сквоша: проверка стадии и иммуностимуляторПРИМЕЧАНИЕ: Этап конкретных трубочные части могут быть раздавлены на слайде микроскопа с крышкой стекла для выполнения морфологического анализа живых клеток фазово-контрастной микроскопии и последующего иммуностея. Новичку рекомендуется использовать этот подход для проверки этапов при ознакомлении с методом микродиссекции с помощью трансиллюминации. Соберите сегмент в объеме 10 мкл с помощью пипетки и переместите его на слайд микроскопа. Раздавливайте трубоубий, аккуратно поместив крышку (20 мм х 20 мм) на трубоубий. В результате клетки вытекают из трубоубий и образуют монослойную клетку. Поместите фильтровальную бумагу на край крышки стекла для облегчения распространения клеток. Избегайте раздавливания клеток слишком много, чтобы держать их в живых. Мониторинг распространения клеток под микроскопом. Используйте фазово-контрастный микроскоп с целью 40x для проверки распознавания этапов путем изучения присутствующих типовклеток (рисунок 2, рисунок S2). После того, как клетки распространились, чтобы сформировать круглый монослой с обоих концов трубоубий, окуните слайд в контейнер, содержащий жидкий азот, удерживая его с типсами. Держите его погруженным в течение 10 с. Кроме того, поместите горку на сухую ледяную плиту для замораживания. Удалите крышку стекла, перевернут его с помощью скальпеля. Без промедления, приступить к фиксации и быстро поместите слайд в контейнер с 90% этанола в течение 2-5 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что препарат сквош не оттаивает перед размещением его до 90% этанола. Другие фиксаторы также могут быть использованы, такие как ацетон, в течение 10 минут. Воздух сухой и хранить при комнатной температуре (RT) (до нескольких дней) или при -80 градусов по Цельсию (долгосрочный). Для иммуностиминга, после фиксации образцов в 4% параформальдегид (PFA) в течение 10 минут на RT. Промыть в PBS и permeabilize с 0,1% Тритон X-100 в PBS в течение 5 мин. Промыть в PBS и нарисовать кольцо жира вокруг каждого образца сквоша. Добавьте 50-100 МКЛ 10% BSA (бивиновый альбумин сыворотки) в 0,1% Tween в PBS (PBST) внутри кольца смазки и блок образцов в течение 30 мин на RT. Удалите раствор BSA и инкубировать с первичным антителом, разбавленным в 10% BSA в PBST в течение 1 ч на RT. Вымойте 3x в течение 5 мин с PBST. Инкубация со вторичным антителом, разбавленным в 10% BSA в PBST.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы испачкать акросомы, образцы могут быть инкубированы с Ромин помечены Арахис агглютинин антитела (PNA, 1:1000) в 10% BSA в PBST для 1 ч на RT (Рисунок S3) вместо конкретных первичных и вторичных антител. Вымойте 3x в течение 5 минут каждый с PBST, промыть PBS и смонтировать с креплением, содержащим DAPI. Цельно-монтажный иммуностимулирование семенных трубокПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе ниже описывается цельно-монтировка окрашивания для постановочных (от шага 2.4) сегментов труб. Если исследователь хочет выполнить цельно-монтажного окрашивания без постановки (от шага 1.5), обратите внимание на ноты в 3.2.1 и 3.2.7. Используя пипетку, перенесите сегменты труб (из шага 2.4) в ледяной PBS в коническую трубку 15 мл и дайте им отложения на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании нестафузных трубок от 1,5., отделить трубоубивания в чашке Петри, трубчатые вверх и обратно на наклонной блюдо несколько раз. Используйте 1-мл пипетку с разрезом наконечником. Этот шаг призван открыть структуру ткани. Тем не менее, избежать слишком много трубопроводов, как это может привести к повреждению труб. Отложения трубок займет несколько десятков секунд. Небольшие фрагменты труб, интерстициальные клетки и клеточный мусор остаются в супернатанте. Аккуратно удалите супернатант (SN) путем пипетки или с аспиратором. Добавьте 10 мл ледяного PBS и смешайте с помощью инверсии. Разрешить осадок, а затем удалить SN, как и раньше. Добавьте 5 мл 4% PFA и зафиксйте на 5 ч на вращающемся столе (20-30 об/мин) при 4 градусах Цельсия.ПРИМЕЧАНИЕ: Время фиксации зависит от белков, представляющих интерес, и их субклеточной локализации. Для ядерных и цитоплазмических белков фиксация 2 ч, как правило, достаточна, однако, мембранных маркеров, таких как GFR-1 (семейный рецептор GDNF alpha 1; Рисунок 6A,B), выгоду от более длительной фиксации, до 6 ч. Разрешить осадок, удалить SN (PFA), как и раньше, и промыть кратко, добавив 10 мл PBS и инвертирования трубки. Разрешить осадок, удалить SN, как и раньше, и повторить PBS стиральный шаг три раза, по крайней мере 10 минут каждый на вращающемся столе при 4 градусов по Цельсию и приступить к окрашивания или хранить при 4 градусов по Цельсию.ПРИМЕЧАНИЕ: Если условия труда стерильны и чисты, образцы могут храниться и использоваться в течение по крайней мере нескольких недель. Кроме того, добавьте Sodium Azide в окончательную концентрацию 0,02% (w/v) из 2% раствора запаса, чтобы помочь сохранить трубоубивания перед хранением при 4 градусах Цельсия. Используя 1-мл пипетку, переместите 10-20 фиксированных сегментов труб в 2-млную круглую нижнюю трубку. Разрешить осадок и удалить SN.ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с длинными трубоубий, которые не были поставлены, залить трубочные трубы на чашку Петри и с помощью микродиссекции ножницы и force сократить сегменты около 5-20 мм. Слишком длинные сегменты будут спутаться во время процедуры окрашивания, в то время как слишком короткие сегменты легко теряются. Добавьте 1 мл 2% BSA и 10% FBS (фетальная сыворотка крупного рогатого скота) в 0,3% Triton X-100 в PBS (PBSX). Блок, по крайней мере 1 ч на вращающемся столе (20-30 об /мин) на RT. Промыть 1 мл PBSX, удалить SN путем пипетки и добавить 250 йл первичного антитела, разбавленного в 1% BSA в PBSX (1:100-1:2000 разбавления). Инкубировать в течение 2 ч на RT или на ночь при 4 градусов по Цельсию на вращающемся столе (20-30 об/мин). Удалите раствор антител путем пипетки и промыть трубоубивания с 1 мл PBSX, как указано выше. Вымойте три раза в течение 1 ч в PBSX на вращающемся столе (20-30 об/мин) на RT.ПРИМЕЧАНИЕ: После этой первой стирки образец можно оставить на ночь при 4 градусах по Цельсию, если это необходимо. Удалить SN и добавить 250 йл вторичных антител, разбавленных в 1% BSA в PBSX (обычно 1:500 разбавления флуоресцентных меткой антитела). Накрыть фольгой и инкубировать на вращающемся столе (20-30 об/мин) на RT за 1 ч. Повторите 3.2.10. Наконец удалить SN и залить трубоубивания на слайд микроскопа. Аккуратно отделите и расположить трубоубичные трубы в линейных полосках с помощью гель-загрузки советы. Слейте лишний буфер и добавьте монтажную среду и крышку.ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте высыхания трубоубий при их организации. В большинстве случаев не требуется контрокрашивание ядер с помощью DAPI. Печать от края крышки с лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание образца и ухудшение. Слайды можно хранить в течение 1-2 недель при 4 градусах цельсия перед визуализацией.

Representative Results

Успешная трансиллюминация при содействии постановки и микроперепись мышей семенных трубочки зависит в первую очередь от нахождения надлежащих условий освещения и подходящий микроскоп вскрытия, а также способность распознавать конкретные особенности, которые характеризуют каждый этап. Этапы VII-VIII кажутся однородно темными, потому что они содержат большое количество полностью конденсированных удлиненных сперматозоидов, которые выровнены на апической поверхности эпителия(рисунок 5A и рисунок S1). После того, как зрелые сперматозоиды высвобождаются в люмен в спермиации, трубка выглядит очень бледной на стадиях IX-XI из-за отсутствия конденсированных удлиненных сперматозоидов в эпителии. Самой простой особенностью для идентификации на трансиллюминированных трубоубийствах является точка спермиации (звездочка на рисунке 5A и рисунок S1), то есть внезапный переход из темной зоны (VII-VIII) в бледную зону (IX-XI). За бледной зоной следует зона слабого пятна (XII-I). Пятнистый внешний вид происходит от организации удлинения сперматозоидов с конденсированным хроматином в пучках. Пучки становятся очень заметными в следующей зоне сильного пятна (II-V). Кроме того, сперматозоиды мигрируют в сторону ядер клеток Сертоли, которые расположены близко к базальной ламине, что отражается как полосатый вид трубоубийки II-V стадии при трансиллюминации(рисунок 2, рисунок 5A,B и рисунок S1). Пучки, наконец, рассеиваются на этапе VI и конденсации удлинения сперматозоидов двигаться близко к люмену, чтобы быть освобождены от эпителия на этапе VIII. Точная стадия сегмента трубчатых трубок может быть точно проверена фазово-контрастной микроскопией препаратов сквоша(рисунок 2 и рисунок S2). Конкретные этапы в сквош препараты признаются на основе акросомального развития шаг 1-8 круглых сперматозоидов, состояние конденсата хроматина в удлиненные сперматозоиды, и наличие сперматозоидов расслоения16 (Рисунок 3 и рисунок S2). Кроме того, наличие более ранних типов клеток, таких как тип B сперматогонии и лептотена или zygotene сперматоцитов, которые могут быть признаны на основе их морфологических особенностей, могут быть использованы для поддержки распознавания этапов. Размер ядер пахитеновых сперматозоидов увеличивается в размерах примерно на VI стадии, что также может оказать дополнительную помощь в постановке. Постановочные препараты сквоша могут быть использованы для изучения экспрессии и локализации белков, представляющих интерес в семенной эпителий с использованием иммуностимунизации. Это позволяет очень точный анализ клеточного типа конкретного выражения из-за четко определенного клеточного состава на каждом этапе. Сценическое выражение может быть дополнительно увеличено путем совместного окрашивания акросомы(например,с PNA), что позволяет визуализировать различные шаги круглой дифференциации спермы. Репрезентативные изображения PNA-окрашенных акросом на различных этапах представлены на рисунке S3. Акросомальные окрашивания также могут быть использованы для определения стадии ретроспективно. Тем не менее, трансиллюминация при содействии постановки значительно проще и быстрее метод, чтобы найти желаемый этап, чем с помощью нестациозных фрагментов в случайной манере. Seminiferous трубочки цельно-монтажного окрашивания, как правило, используется для изучения типов клеток, которые находятся в контакте с мембраной подвала семенной эпителия, либо на трубчатой стороне (сперматогония, прелептотиновые сперматозоиды и клетки Сертоли; Рисунок 6A,B) или интерстициальная сторона (перитубулярные миоидные клетки и перитубубные макрофаги; Рисунок 6C и рисунок S4A)24. Тем не менее, метод также может быть использован для изучения клеток или структур, которые расположены глубже в эпителии, такие как гембицефалический барьер (Espin, Рисунок S4B), или постмейотических зародышевых клеток (акросомный маркер PNA, рисунок S4C). При использовании нестатиированных сегментов труб, можно оценить данный этап ретроспективно с помощью антитела противбелка, который выражается в дифференциациисперматозоидов (A1, A2, A3, A4, In и B; коллективно A diff ) (Рисунок 2). Постановка затем опирается на плотность синцитиальныхдифф, которые проходят шесть митотических делений в стадии зависимой образом во время первого цикла сперматогеннойдифференциации 1, поэтомуудвоение числа дифф сперматогонии в синцитии после каждогоразделения 1,25. Тем не менее, ретроспективная постановка менее точна, чем трансиллюминация с помощью постановки,потому что нет никаких конкретных маркеров для отдельных поколений A diffи оценка плотности дифф может быть подвержена ошибкам. Рисунок 1: Семиниферная эпителиальная карта цикла для постановки сперматогенеза мыши. Вертикальные столбцы показывают клеточные ассоциации на разных стадиях семенного эпителиального цикла (отмечены римскими цифрами I-XII). Самые незрелые зародышевые клетки находятся внизу, в то время как наиболее дифференцированные находятся в верхней части. Чтобы следить за ходом дифференциации зародышевых клеток, нужно двигаться слева направо, а снизу вверх. Цикл семенного эпителия – это полная серия этапов, которые следуют друг за другом в численном порядке. Унд,недифференцированная сперматогония; A1-4, тип A1-A4 сперматозоидов; В промежуточной сперматогонии; B, тип B сперматогония; Pl, прелептотенные сперматозоиды; L, лептотенные сперматозоиды; Вопрос, zygotene сперматомоциты; P, пахитенные сперматозоиды; D, диплотеновые сперматозоиды; 2 “, вторичные сперматозоиды плюс мейотические деления. Арабские цифры 1-16 относятся к шагам постмейотических сперматозоидов созревания (спермиогенез). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Клеточные ассоциации на этапах семенного эпителиального цикла мыши. Этапы семенного эпителиального цикла следуют друг за другом в логическом порядке и таким образом образуют сперматогенную волну вдоль продольной оси семенной трубочки. Верхняя панель иллюстрирует ассоциации зародышевых клеток на разных стадиях, а также расположение типов клеток в цитоплазмических карманах клеток Сертоли (светло-серый) в семенном эпителии. Иллюстрация семенной трубочки визуализирует сперматогенную волну и специфические модели трансилюминации бледного, слабого места, сильного пятна и темных зон. С каждого указанного этапа показаны репрезентативные фазо-контрастные изображения фазовой контрастности живых клеток препаратов сквоша и периодических кислотно-шиффов (PAS)-окрашенных поперечных сечений яичка. Нижние две панели показывают сегменты семенной трубочки после трансиллюминации (вверху) или окрашивания антителами (внизу) против SALL4 (красный, пан-сперматогониальный маркер) и DNMT3A (зеленый,дифф маркер). Модели трансиллюминации для этапов IX-XI, XII и VI выделены коробчатыми областями. Для определения (приблизительной) стадии семенного цикла можно использовать как модель поглощения света (вверху), так и плотность DNMT3A-положительной дифференциации сперматозоидов (внизу). Последующие поколения Adiff называются типом A1-A4, промежуточным (In) и типом B сперматозоидов. Разделение каждого приводит к удвоению плотности сперматозоидов клеток. Самая высокая плотность клеток на мембране подвала семенного эпителия наблюдается в этапах VI-VIII, когда наблюдаются меиотические прелептотеновые сперматозоиды (Pl). Шкала баров: сквош prep. 10 мкм, другие 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Шаги спермиогенеза. Отличительные особенности сперматозоидов на разных этапах спермиогенеза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Рабочий процесс этого исследования. Шаблон трансиллюминации был полностью установлен во взрослой мыши. Пожертвовать мышью и приступить к вскрытию яичка и декапсуляции без промедления. Аккуратно потяните трубошки друг от друга на чашку Петри. Зафиксировать трубоубийства для цельно-монтажных окрашивания или приступить к трансиллюминации. Под трансилюминацией 1) вырезать короткие сегменты трубоубий конкретной стадии (ы) для препаратов сквоша (контроль качества или для иммуностимулирования) или 2) сократить более длинные сегменты для сбора этапных бассейнов для анализа РНК и протеомики, культуры тканей или для цельно-монтажных окрашивания. Передача коротких сегментов трубоубий на слайд микроскопа в объеме 10 МКЛ PBS. Поместите крышку скольжения на сегменте, чтобы вынузить клетки и сформировать монослой живой ячейки. Наблюдайте типы клеток под микроскопом, затем исправить и пятно. WMS, цельноукрепление окрашивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Семиниферные трубочки взрослой мыши, как видно под трансиллюминации микроскопии. (A) Длинный сегмент семенной трубочки, как видно под трансилюминации отображения волны семенной эпителия. Четыре различные зоны могут быть определены на основе уплотнения хроматина в сперматозоидах и их локализации в эпителии: темная зона (этапы VII-VIII), бледная зона (этапы IX-XI), зона слабых мест (этапы XII-I) и зона сильного пятна (этапы II-VI). Звездочка, точка спермиации. Стрелки указывают на два коротких сегмента в зоне слабого пятна, которые имеют бледный вид из-за механической нагрузки на трубоубий. Шкала бар: 500 мкм. Insets 1-5 являются более высокими увеличениями от выбранных сегментов труб. (B) Объединили сегменты семенной трубочки, представляющие этапы II-V (зона сильного пятна), VII-VIII (темная зона) и IX-XI (бледная зона). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 6: Цельно-монтажные иммуностимулирования с использованием сперматозоидов, клеток Сертоли и перитубулярных маркеров макрофага. (A) Цельноукрепление окрашивания для сегмента, представляющего этап XI-II с антителами против GFR-1 (красный), SALL4 (зеленый) и DNMT3B (синий). Окрашивание показывает три различных популяций сперматозоидов: потихонька изолированных (A s) илипарных(pr) недифференцированных стволовых сперматозоидов (GFR-1) /SALL4/DNMT3B – ;белыепунктирные области), короткие синцитиальные (здесь 4 выровненные клетки; Aal4) прародитель сперматогонии (GFR-1 -/SALL4 /DNMT3B – ;желтыепунктирные области) и дифференциации сперматозоидов (GFR-1 -/SALL4 / DNMT3B ). SALL4/DNMT3B- это сперматозоиды типа A3-A4. (B)Цельно-монтажные семенные трубочки, окрашивающиеся антителами против GFR-1 (красный), USF1 (зеленый) и SOX9 (синий). GFR-1 окрашивает подмножество стволовых сперматозоидов. USF1 выражается как сперматозоидами, так иклетками SOX9 и Sertoli. (C)Перитубулярные макрофаги у взрослых мышей являются положительными как для F4/80 (красный) и MHCII (синий). DAPI окрашивает ДНК (зеленый). Яркие большие ядра являются перитубулярными ядрами миоидных клеток. Шкала баров: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок S1: Длинный сегмент семенной трубочки, как видно под трансиллюминации отображения волны семенной эпителия. Четыре различные зоны могут быть определены на основе уплотнения хроматина в сперматозоидах и их локализации в эпителии: зона слабых мест (этапы XII-I), зона сильного пятна (этапы II-VI), темная зона (этапы VII-VIII) и бледная зона (этапы IX-XI). Точка спермиации (звездочка) может быть признана темной зоной, внезапно транзитом в бледную зону. Шкала бар: 500 мкм. Врезки 1-4 являются более высокими увеличениями от выбранных сегментов труб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру. Рисунок S2: Фазово-контрастная микроскопия живых клеток-монослой различных стадий семенного эпителиального цикла. (A) Этап I. Шаг 1 круглые сперматозоиды по-прежнему не хватает акросомальной структуры. Они характеризуются небольшим круглым ядром (красными кругами) с характерным одним хромоцентром (белые стрелки). Хроматоидное тело видно в цитоплазме как темная гранула в тесном контакте с ядерной мембраной (синие стрелки). Ядро клетки Сертоли (белый круг) содержит три темных очага: большой нуклеол с двумя спутниковыми хромоцентрами. Sertoli клетки unoften видели в сквош препаратов, но они иногда вытекают из трубоубивания вместе с зародышевых клеток. (B)Этап II-IV. В шаге 4 круглые сперматозоиды (красные круги), акросомальная структура (красные стрелки) появляется как белый слегка сплющенный пузырьк, прикрепленный к ядерной оболочке. Удлинение сперматозоидов образуют пучки и уже имеют толстый flagellum (белые стрелки), указывающие на наличие митохондриальной оболочки в середине части хвоста спермы. Ядра пахитеновых сперматозоидов (PSpc) примерно в два раза больше, чем у круглых сперматозоидов и характеризуются темными хроматинными регионами, распределенными по всему ядру. (C)Этап V-VI. В шаге 5-6 круглых сперматозоидов (красный круг), акросома дополнительно сплющивается и распространяется по ядру (красные стрелки). Область ядерной оболочки, обращенной к акросоме, кажется темной из-за присутствия акроплаксома, богатой белком пластины между акросомной мембраной и ядерной мембраной. Удлинение сперматозоидов высвобождается из пучков (белые стрелки). Пахитен сперматозоиды (PSpc) часто наблюдаются в эпителии. (D)Этап VII-VIII. Акросома (красные стрелки), темная подкладка на ядерном конверте с белыми тенями, полностью расширена и охватывает почти всю апическую сторону шага 7-8 круглых сперматозоидов (красные круги). Эта стадия характеризуется зрелыми сперматозоидами (белыми стрелами), которые могут быть в изобилии на многих частях подготовки сквоша. Ядро пахитеновых сперматозоидов (PSpc) растет в размерах во время развития и появляются больше в стадии VII-VIII, чем на предыдущих стадиях. Темные хроматиновые области внутри ядра пахитеновых сперматозоидов (PSpc) кажутся нечеткими из-за высокой транскрипционные активности и мейотические события. (E)Этап X. Шаг 10 сперматозоидов ядра (белые стрелки) инициировали удлинение, но хроматин еще не конденсируется. Акросомы начинают формировать крючок на ядерном кончике (красная стрелка). Ядра пахитеновых сперматозоидов (PSpc) кажутся очень большими, поскольку они готовятся к мейотических делений. (F)Этап XII. Этап XII характеризуется наличием мейотических метафазных пластин (белых разбитых кругов). Небольшие круглые клетки с типичной конденсированной хроматиновой моделью являются zygotene сперматомоцитов (ЗСПК), в котором сестра хромосомы выравнивания инициировать синаптонемальное комплексное образование. Шкала баров: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру. Рисунок S3: Определение стадии семенного эпителиального цикла на основе акросомального и ядерного окрашивания. Ацетон-фиксированные препараты сквош были окрашены Ромамин-спряженных ПНА и DAPI. Этап I: Хотя не акросома не существует в шаге 1 круглые сперматозоиды полностью развитой акросомы могут быть обнаружены в удлиненные сперматозоиды. Этапы II-IV: Акросомное развитие начинается с появления проакросомальных/акросомальных гранул в круглых сперматозоидах. Акросомальная пузырька на ядерной поверхности появляется вокруг до шага 3 сперматозоидов, а затем выравнивается в шаге 4 сперматозоидов. Этап V: Угол, подаемый акросомой, простирается от 40 градусов до максимум 95 градусов. Этапы VI-VII: Угол, поделенный акросомой, простирается от 95 градусов до 120 градусов. Этапы VIII-IX: акросома полностью расширена в шаге 8 сперматозоидов (этап VIII), и ядра поляризуются на апической стороне клетки, внося контакт с плазменной мембраной (не показано). К ЭТАП IX ядро сперматозоидов деформируется; спинной и брюшной поверхности впервые видны. Этапы X-XI: Сперматозоиды показывают спинной угол. Этап XII: Этот этап лучше всего характеризуется появлением мейотических отделов; метафазные пластины обозначены белыми стрелками. Удлинение сперматозоидов с их акросомы также видели. Шкала баров: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру. Рисунок S4: Цельное окрашивание для нетрадиционных маркеров. (A) Альфа гладкий актин мышцы (aSMA) выражается перитубубных миоидных клеток. (B) Эспин локализует к соединениям клетки Sertoli плотных и способствует к барьеру blood-testis. (C) PNA локализуется до акросом сперматозоидов. Шкала баров: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру. Дополнительное видео 1: Резка короткого сегмента семенной трубочки, представляющей этап VII-VIII. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Discussion

Метод микродиссекции с помощью трансиллюминации, описанный выше, позволяет использовать сценический подход к изучению сперматогенеза. Сперматогенез является высоко синхронизированным процессом, и все ключевые шаги во время сперматогенной дифференциации регулируются и выполняются в стадии зависимой манеры, такие как дифференциация обязательств (на этапах VII-VIII), начало мейоза (VII-VIII), мейотических деления (XII), наступление сперматозоидов удлинение (VIII) и сперматозоидов (VIII)1,26,27. Сценический анализ является мощным инструментом для изучения этих конкретных событий, которые ограничиваются конкретными шагами сперматогенеза и поэтому находятся только на определенных стадиях семенного эпителиального цикла. Освоение метода занимает некоторую практику и использование хорошего качества рассечения микроскопа и надлежащего освещения условия являются ключом к успеху. Реализация этого метода в рамках повседневного инструментария имеет возможность значительно улучшить воздействие и биологическую значимость исследований мужских репродуктивных функций, позволяя более точное вскрытие молекулярных событий во время сперматогенеза.

Все штаммы WT мыши, которые мы изучали, отображают аналогичный рисунок трансиллюминации и демонстрируют сохраненные клеточные ассоциации на стадиях семенного эпителиального цикла. При условии, что спермиогенная дифференциация зародышевых клеток не сильно отличается от WT мышей, то же самое относится и ко всем нокаут-модели мыши, которые мы изучали. Кроме того, он может быть применен к другим видам, которые демонстрируют продольное сегментальное расположение этапов семенного эпителиального цикла7. Однако виды с не сегментатальными стадиями (например, человеческие) не могут быть использованы. Учитывая существенную роль конденсата хроматина в удлинению сперматозоидов в определении модели трансиллюминации, ясно, что любое неправильное регулирование этого процесса неизбежно посягает на реализацию этого метода. У несовершеннолетних мышей и молодых людей (5-6 недель) модель трансиллюминации еще не полностью установлена, и, следовательно, следует использовать только мышей старше 8 недель. Важно также иметь в виду, что сжатие и потянув трубочки неизбежно посягает на трансилюминации картины, поскольку она искажает клеточной архитектуры в семенной эпителия.

Изолированные семенные сегменты трубочки также могут быть культурно, что позволяет ex vivo наблюдения и манипуляции сперматозоидов связанных процессов, в том числе мейоз. Для обеспечения жизнеспособности тканей и предотвращения деградации РНК и белка, образцы должны быть собраны и обработаны не более чем через 2 часа после жертвоприношения мыши. Для культуры ex vivo семенных трубоубийств время от жертвоприношения до наступления культуры не должно превышать 1 часа. Целостность фрагментов труб, как правило, может поддерживаться до 72 часов в пробирке, если собраны должным образом.

Стадию семенного эпителиального цикла можно проверить и еще точнее определить с помощью фазо-контрастной микроскопии препаратов сквоша16. Микроскопия проводится на живых клетках, что обеспечивает дополнительное измерение в анализе и позволяет наблюдение органеллы или клеточных движений на определенных стадияхсперматогенеза 28,29,30. Фазово-контрастная микроскопия обеспечивает точную постановку для последующего иммуностимунизации, что позволяет очень детально анализировать экспрессию белка и динамику локализации при сперматогенезе, включая сценические изменения.

В то время как клетки высвобождаются из эпителиального контекста в препаратах сквоша, цельно-монтажные иммуностимулы трубчатых сегментов позволяют изучать сперматогенные клетки в их физиологической среде. Таким образом, цельно-монтажные препараты могут обеспечить лучшую визуализацию семенной трубчатой архитектуры и ее межклеточных контактов, чем иммуностимулирование на поперечных сечениях. Важно отметить, что трансиллюминация при содействии постановки сегментов трубоубий до иммуностения делает подход еще более мощным, включив информацию о конкретном этапе данного сегмента. Цельно-монтажное окрашивание является особенно полезным инструментом для изучения клеток на периферии семенных трубоубийств, таких как перитубубулярные миоидные клетки, перитубулярные макрофаги и сперматозоиды, но может также открыть новые идеи в исследованиях по мейотических и постмейотических зародышевых клеток.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами От Академии Финляндии (315948, 314387 до Н.К.); Фонд Сигрида Джуслиуса (В.К., Дж.Т.); Фонд Эмиля Аалтонена (J.-A.M., T.L.); Докторская программа Турку молекулярной медицины (S.C.-M., O.O.).

Materials

bovine serum albumin (BSA) Sigma A9647
cover glass 20×20 mm Menzel Gläser 11961988
Falcon conical tube 15-ml Sarstedt 62.554.502
fetal bovine serum (FBS) Biowest S1810
grease pen (ImmEdge) Vector Laboratories H-4000
microscope slide Superfrost Plus Thermo Scientific 22-037-246
Parafolmaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15714
Petri dish (100-mm) Greiner 664160
phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 11503387
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher P36962
rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) Vector Laboratories RL-1072
Triton X-100 Sigma 93443
Tween-20 Sigma P2287
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis Physiology: Seminiferous Cycle. Encyclopedia of Reproduction. , (2018).
  2. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
  3. Clermont, Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).
  4. Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. The wave of the seminiferous epithelium in the rat. American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).
  5. de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., França, L. Testis Physiology-Overview and Histology. Encyclopedia of Reproduction. , (2018).
  6. Leblond, C. P., Clermont, Y. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat. Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).
  7. Parvinen, M. Regulation of the seminiferous epithelium. Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).
  8. Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
  9. Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice. Reproduction. 154 (5), 569-579 (2017).
  10. Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. . Histological and histopathological evaluation of the testis. , (1990).
  11. Parvinen, M., Hecht, N. B. Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for “in situ” analyses of DNA polymerase activities. Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).
  12. Ventelä, S., Mäkelä, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis. Stem Cells. 30 (5), 1008-1020 (2012).
  13. Faisal, I., et al. Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice. Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).
  14. Wright, W. W., et al. Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules. Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).
  15. Johnston, D. S., et al. Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).
  16. Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium. Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).
  17. Mäkelä, J. A., et al. Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis. Reproduction. 142 (5), 711-721 (2011).
  18. La, H. M., et al. Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline. Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).
  19. Toppari, J., Parvinen, M. In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis. Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).
  20. Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat. The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).
  21. Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).
  22. Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
  23. Chan, A. L., et al. Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes. Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).
  24. Lokka, E., et al. Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis. Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).
  25. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium. Encyclopedia of Reproduction. , (2018).
  26. Griswold, M. D. Spermatogenesis: The commitment to meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
  27. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Spermatogenesis. Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).
  28. Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).
  29. Parvinen, M., Parvinen, L. M. Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products. The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).
  30. Parvinen, M., Söderström, K. O. Chromosome rotation and formation of synapsis. Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).

Tags

TransilluminationSeminiferous Epithelial CycleSpermatogenesisMouse TestesDissectionImmunostaining

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mäkelä, J., Cisneros-Montalvo, S., Lehtiniemi, T., Olotu, O., La, H. M., Toppari, J., Hobbs, R. M., Parvinen, M., Kotaja, N. Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses. J. Vis. Exp. (164), e61800, doi:10.3791/61800 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image