التسلخ المُساعد للتنقية في مراحل محددة من دورة الظهارة الظهارية شبه المائلة للماوس لتحليلات المناعة المصبية
Summary
يصف هذا البروتوكول ميكروديستيون بمساعدة الترانويلومي من أجزاء من الأنابيب الماوس الكبار شبهiferous التي تمثل مراحل محددة من دورة الظهارة شبه المائلة، وأنواع الخلايا فيها، والمناعة اللاحقة من الاستعدادات الاسكواش وقطاعات الأنابيب سليمة.
Abstract
الحيوانات المنوية هي عملية تمايز فريدة من نوعها التي تؤدي في نهاية المطاف إلى واحد من أنواع الخلايا الأكثر تميزا في الجسم، والحيوانات المنوية. تمايز الخلايا الجرثومية يحدث في جيوب السيتوبلازمية من خلايا Sertoli الجسدية التي تستضيف 4 إلى 5 أجيال من الخلايا الجرثومية في وقت واحد وتنسيق وتزامن تطورها. ولذلك ، فإن تكوين أنواع الخلايا الجرثومية داخل المقطع المقطعي ثابت ، وتعرف هذه الارتباطات الخلوية أيضًا باسم المراحل (I-XII) من الدورة الظهارية شبه المائلة. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تكون مراحل تحديد من الأنابيب شبهiferous سليمة على أساس خصائصها امتصاص الضوء التفريقي / مبعثر كشفت عن طريق transillumination، وحقيقة أن المراحل تتبع بعضها البعض على طول أنبوب في ترتيب عددي. توضح هذه المقالة طريقة microdissection بمساعدة transillumination لعزل شرائح أنبوبية seminiferous تمثل مراحل محددة من دورة الظهارية الظهارية الماوس شبه. يتم فحص نمط امتصاص الضوء من الأنابيب شبهiferous أولا تحت مجهر تشريح، ومن ثم يتم قطع شرائح أنبوب التي تمثل مراحل محددة واستخدامها في التطبيقات المصب. هنا نصف بروتوكولات المناعة لإعدادات الاسكواش الخاصة بالمرحلة ولأجزاء الأنابيب السليمة. هذه الطريقة تسمح للباحث بالتركيز على الأحداث البيولوجية التي تحدث في مراحل محددة من تكوين الحيوانات المنوية ، وبالتالي توفير أداة فريدة للدراسات التنموية والسمية ، والسيولوجية من الحيوانات المنوية والآليات الجزيئية الكامنة.
Introduction
تمايز الخلايا الجرثومية الذكور من الحيوانات المنوية diploid إلى الحيوانات المنوية هابلويد ناضجة، أي، الحيوانات المنوية، هو عملية معقدة التي تجري في ظهارة من الأنابيب شبهiferous في الخصيتين للفرد ناضجة جنسيا1. أحفاد Mitotic من الحيوانات المنوية A1 تقسيم أول خمس مرات لتوسيع السكان ملتزمة التمايز، ثم أدخل meiosis كما spermatocytes التي تؤدي في نهاية المطاف إلى الحيوانات المنوية haploid. التمايز بين الحيوانات المنوية المستديرة في الحيوانات المنوية، أي،تكوين الحيوانات المنوية، ينطوي على تغييرات معقدة في مورفولوجيا الخلايا، بما في ذلك الضغط النووي وبناء الهياكل الخاصة بالحيوانات المنوية مثل المضاداتبوم و flagellum. في الماوس ، تستغرق عملية تكوين الحيوانات المنوية 35 يومًا لإكمال2،3.
في أي لغة معينة، يستضيف الظهارة شبه المنيفيرة ما يصل إلى خمسة أفواج من الخلايا الجرثومية المميّزة بالإضافة إلى الخلايا الجذعية/السلفة والجراثيمية وخلايا سيرتولي الجسدية1. تميز الخلايا الجرثومية تشكل طبقات متحدة المركز تكوين الذي يمكن التنبؤ بها، وخلايا haploid في خطوة معينة من التنمية دائما المنتسبين مع أنواع معينة من الحيوانات المنوية والحيوانات المنوية4،5. ولذلك، فإن أي مقطع مُنَطَمِي من أنبوب يستضيف أفواج من الخلايا الجرثومية ذات التركيب الثابت. وتعرف هذه الجمعيات الخلية المحددة على أنها مراحل ظهارة شبهiferous. مراحل في حد ذاته لا تقدم راكدة نقطة الاختيار مثل الدول ولكن تتطور باستمرار كما التمايز من الأفواج الخلية الجرثومية يتقدم في متزامن1,2,6. في الفئران ، هناك 12 مرحلة (I-XII)2 التي يتم ترتيبها بطريقة مجزأة على طول المحور الطولي من أنبوب سينيفيروي ، ويتبعون بعضهم البعض في ترتيب منطقي وبالتالي تشكيل موجة من ظهارة شبه مفطورة ، أو موجة الحيوانات المنوية7،8،9 ( الشكل1). الانتهاء من الحيوانات المنوية يأخذ أربع دورات، والطبقات الهرمية أو أفواج من الخلايا الجرثومية التمييز داخل أي المقطع المقطع عرضية أنبوب شبهي هي مؤقتا دورة واحدة شبهية وبصرف النظر عن بعضها البعض. طول الدورة تعتمد على الأنواع وفي الماوس كل دورة يأخذ 8.6 أيام10.
ويمكن تحديد المراحل على أساس التكوين الخلوي وتنظيم الظهارة شبهiferous على الخصيتين الهَنَسيَّةأقسام 5 (الشكل 1 والشكل 2). ومع ذلك، التحليل النسيجي شاقة، تستغرق وقتا طويلا ويتطلب تحديد وتلطيخ، وبالتالي لا يمكن تطبيقها على الأنسجة الحية. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن يكون تنظيم على الأنسجة الحية تحت مجهر تشريح من خلال الاستفادة من أنماط امتصاص الضوء /مبعثر متميزة التي تظهرها مراحل مختلفة من الدورة(الشكل 2). قدرة كل مرحلة على امتصاص وتشتت الضوء هو نسبة إلى مستوى التكثيف كروماتين من الحيوانات المنوية في وقت متأخر بعد الظهارية أن أي مرحلة معينة تستضيف وتعبئة هذه الخلايا في حزم7,11. تمايز الحيوانات المنوية، أيتكوين الحيوانات المنوية، وينقسم إلى 16 خطوة تنموية، بما في ذلك 8 خطوات من الحيوانات المنوية المستديرة (الخطوة 1-8) و8 خطوات من الحيوانات المنوية الممدود (الخطوات 9-16) التمايز(الشكل 1). الخطوة 9-11 ممدود الحيوانات المنوية (المرحلة التاسعة الحادية عشرة) عرض مستوى منخفض فقط من التكثيف الكروماتين مما أدى إلى كمية منخفضة من الضوء يجري امتصاصها. يبدأ تكثيف كروماتين في الخطوة 11 spermatids (المرحلة الحادية عشرة)، والخطوة 15-16 ممدود الحيوانات المنوية (المرحلة الرابعة-الثامنة) تحتوي على الكروماتين المكثفة بالكامل، وبالتالي يحمل امتصاص الضوء الأقصى(الشكل 3). الكروماتين يحتاج إلى أن يكون مكثفا من أجل أن تكون معبأة بإحكام في رأس الحيوانات المنوية. العوامل الإضافية التي تسهم في نمط امتصاص الضوء هي موقع الحيوانات المنوية الممدود داخل الظهارة (القاعدية مقابل apical) وتجميع الحيوانات المنوية الممدود (وضوحا في المراحل الثانية- V)11 (الشكل 3). وينظر إلى حزم والبقع في منتصف الأنابيب والمشارب على حواف تحت مجهر تشريح وأكثر مكثف الكروماتين، قتامة بقعة / شريط11.
توضح هذه المقالة استخدام طريقة microdissection بمساعدة transillumination لعزل شرائح أنبوبية شبهiferous تمثل مراحل محددة من دورة الظهارية seminiferous. مرة واحدة معزولة، يمكن أن تخضع قطاعات أنبوبي مراحل لمختلف التحليلات المصب، بما في ذلك الحمض النووي الحيوي وتحليلات البروتين12،13،14،15، تدفق cytometry16، السابقين فيفو tubule الثقافة17 والمناعة18. هنا نقدم أيضا بروتوكولات مفصلة المصب لإعداد أحادية الطبقات المسحقة من شرائح الأنابيب مراحل لتحليل الخلايا الحية والمناعة اللاحقة، فضلا عن مناعة كاملة جبل من شرائح tubule. سير العمل في باختصار في وصفها في الشكل 4.
تسمح طريقة التشخيص المجهري بمساعدة الترانسيلومين بالتعريف الدقيق وعزل الخلايا الجرثومية في خطوات محددة من التمايز بفضل التركيب الخلوي المتزامن للمراحل. الأهم من ذلك، فإنه يتيح أيضا دراسة الأحداث التي تعتمد على مرحلة خلال تكوين الحيوانات المنوية على الأنسجة الحية. ونظرا لعدم وجود نماذج قابلة للتطوير في المختبر لـ spermatogenesis، وهذا الأسلوب أيضا ميزة فريدة من نوعها للسماح المستهدفة دراسات النمو والسمية على مراحل المرحلة محددة الأنابيب قطاعات السابقين vivo12،17. بينما نحن وصف الأسلوب هنا للفأر، يمكن تطبيق نفس الإجراء على أي أنواع الثدييات مع ترتيب طولي وجزئي من المراحل الظهارية شبه المائلة، مثل الفئران4،7،15،19،20.
Protocol
Representative Results
Discussion
طريقة الميكرويسيرات بمساعدة الترانويلوميين التي وصفناها أعلاه تمكن من اتباع نهج موجه نحو المرحلة لدراسة تكوين الحيوانات المنوية. إنّ تكوين الحيوانات المنوية عملية متزامنة للغاية، وجميع الخطوات الرئيسية خلال التمايز المنوي تُنظَّم وتُنفَّذ بطريقة تعتمد على المرحلة، مثل التزام التمايز (في المراحل السابعة إلى الثامنة)، وبداية الداء (VII-VIII)، والتقسيمات الميوتيكية (XII)، وبداية استطالة النطاف المنوية (الثامن) والحيوانات المنوية (الثامن)1،26،27. يوفر التحليل الموجه نحو المرحلة أداة قوية لدراسة هذه الأحداث الخاصة التي تقتصر على خطوات محددة من تكوين الحيوانات المنوية وبالتالي لا توجد إلا في مراحل محددة من دورة الظهارية شبه المائلة. اتقان الأسلوب يأخذ بعض الممارسة واستخدام مجهر تشريح ذات نوعية جيدة والظروف المناسبة مضيئة هي مفتاح النجاح. تنفيذ هذه الطريقة كجزء من مجموعة أدوات اليومية لديه القدرة على تحسين كبير في تأثير وأهمية البيولوجية للبحوث على وظائف الإنجاب الذكور من خلال السماح تشريح أكثر دقة للأحداث الجزيئية أثناء تكوين الحيوانات المنوية.
جميع سلالات الماوس WT التي درسناها عرض نمط مماثل transillumination وعرض الجمعيات الخلوية المحفوظة في مراحل من دورة الظهارية seminiferous. على شرط أن التمايز spermiogenic من الخلايا الجرثومية لا يختلف اختلافا صارخا عن الفئران WT، وينطبق الشيء نفسه أيضا على جميع نماذج الماوس خروج المغلوب التي درسناها. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن تطبيقها على الأنواع الأخرى التي تظهر الترتيب القطاعي الطولي من مراحل دورة الظهارية شبه7. ومع ذلك، لا يمكن استخدام الأنواع ذات المراحل غير المجزأة (مثل الإنسان). نظرا للدور الأساسي للتكثيف الكروماتين في ممدود الحيوانات المنوية في تحديد نمط transillumination، فمن الواضح أن أي سوء تنظيم هذه العملية سوف تمس حتما على تنفيذ هذه الطريقة. في الفئران الشابة والشباب (5-6 أسابيع) لم يتم بعد تحديد نمط الترانسيليمين بشكل كامل ، وبالتالي ، يجب استخدام الفئران التي تزيد أعمارهم عن 8 أسابيع فقط. من المهم أيضا أن نضع في اعتبارنا أن الضغط وسحب الأنابيب سوف تؤثر حتما على نمط الترانسيلومين لأنه يشوه العمارة الخلوية داخل ظهارة شبهiferous.
ويمكن أيضا أن تكون شرائح الأنابيب seminiferous المعزولة المستزرعة تمكين مراقبة الجسم الحي السابق والتلاعب في العمليات المقترنة بالحيوانات المنوية، بما في ذلك الميوسيس. لضمان صلاحية الأنسجة ومنع تحلل الحمض النووي الريبي والبروتين، يجب جمع العينات ومعالجتها على ألا تزيد عن ساعتين بعد التضحية بالماوس. لثقافة vivo السابقين من الأنابيب seminiferous، وينبغي أن الوقت من التضحية إلى بداية الثقافة لا تتجاوز 1 ساعة. يمكن عادة الحفاظ على سلامة شظايا الأنابيب تصل إلى 72 ساعة في المختبر إذا تم حصادها بشكل صحيح.
يمكن التحقق من مرحلة دورة الظهارية شبه المائلة، بل وتحديدها بدقة أكبر باستخدام المجهر على النقيض من مرحلة من تحضيرات الاسكواش16. يتم إجراء المجهر على الخلايا الحية، والذي يوفر بعدا إضافيا في التحليل ويسمح بمراقبة حركات العضية أو الخلية في مراحل محددة من تكوين الحيوانات المنوية28،29،30. يوفر المجهر على النقيض من الطور التدريج الدقيق لـ مناعة لاحقة ، مما يتيح إجراء تحليل مفصل جدًا للتعبير البروتيني وديناميات التعريب أثناء تكوين الحيوانات المنوية ، بما في ذلك التغييرات الخاصة بالمرحلة.
في حين يتم تحرير الخلايا من السياق الظهارية في الاستعدادات الاسكواش، والمناعة كامل جبل من شرائح أنبوب تمكين دراسة الخلايا المنوية في بيئتها الفسيولوجية. لذلك ، قد توفر الاستعدادات الكاملة تصورًا أفضل لهندسة الأنابيب شبه المنيفيرة ومخالطها بين الخلايا من الاحتفاظ بالمناعة على المقاطع العرضية. والأهم من ذلك أن التدريج بمساعدة الترانسيلومين للأجزاء الأنبوبية قبل الكبت المناعي يجعل النهج أكثر قوة من خلال تضمين معلومات عن المرحلة المحددة لشريحة معينة. تلوين كامل جبل هو أداة مفيدة بشكل خاص لدراسة الخلايا في محيط الأنابيب شبهiferous، مثل الخلايا العضلية peritubular، الضامة المحيطة والحيوانات المنوية، ولكن قد تفتح أيضا رؤى جديدة في البحوث على الخلايا الجرثومية الميوخية وما بعد الميكونية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل منح من أكاديمية فنلندا [315948، 314387 إلى ن.ك.]؛ مؤسسة سيغريد جوسليوس [إلى ن.ك.، ج.ت]؛ مؤسسة إميل آلتونن [إلى J.-A.M، T.L.]؛ برنامج توركو للدكتوراه في الطب الجزيئي [S.C-M., O.].
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
| cover glass 20×20 mm | Menzel Gläser | 11961988 | |
| Falcon conical tube 15-ml | Sarstedt | 62.554.502 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
| grease pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | |
| microscope slide Superfrost Plus | Thermo Scientific | 22-037-246 | |
| Parafolmaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Petri dish (100-mm) | Greiner | 664160 | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 11503387 | |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36962 | |
| rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
- Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis Physiology: Seminiferous Cycle. Encyclopedia of Reproduction. , (2018).
- Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
- Clermont, Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).
- Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. The wave of the seminiferous epithelium in the rat. American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).
- de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., França, L. Testis Physiology-Overview and Histology. Encyclopedia of Reproduction. , (2018).
- Leblond, C. P., Clermont, Y. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat. Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).
- Parvinen, M. Regulation of the seminiferous epithelium. Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice. Reproduction. 154 (5), 569-579 (2017).
- Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. . Histological and histopathological evaluation of the testis. , (1990).
- Parvinen, M., Hecht, N. B. Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for “in situ” analyses of DNA polymerase activities. Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).
- Ventelä, S., Mäkelä, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis. Stem Cells. 30 (5), 1008-1020 (2012).
- Faisal, I., et al. Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice. Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).
- Wright, W. W., et al. Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules. Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).
- Johnston, D. S., et al. Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).
- Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium. Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).
- Mäkelä, J. A., et al. Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis. Reproduction. 142 (5), 711-721 (2011).
- La, H. M., et al. Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline. Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).
- Toppari, J., Parvinen, M. In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis. Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).
- Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat. The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Chan, A. L., et al. Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes. Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).
- Lokka, E., et al. Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis. Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).
- Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium. Encyclopedia of Reproduction. , (2018).
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The commitment to meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Mäkelä, J. A., Toppari, J. Spermatogenesis. Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).
- Parvinen, M., Parvinen, L. M. Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products. The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).
- Parvinen, M., Söderström, K. O. Chromosome rotation and formation of synapsis. Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).
