Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi
Summary
Bu protokol, gelişmiş özellik ekstraksiyonu ve biyoinformatik analiz yazılımı ile birlikte sıvı kromatografi kütle spektrometresi kullanılarak peptidoglikan bileşiminin ayrıntılı bir analizini kapsar.
Abstract
Peptidoglikan, bakteriyel hücre duvarlarının önemli bir bileşenidir ve antimikrobiyaller için ortak bir hücresel hedeftir. Peptidoglikan yapısının yönleri tüm bakterilerde oldukça korunmuş olsa da, Gram-pozitifler / negatifler arasında ve türler arasında da önemli farklılıklar vardır. Ek olarak, büyüme fazına ve / veya çevresel uyaranlara yanıt olarak bir bakteri türünde meydana gelebilecek peptidoglikan için bilinen çok sayıda varyasyon, modifikasyon veya adaptasyon vardır. Bu varyasyonlar, büyüme / bölünme, antibiyotik direnci ve konakçı savunmasından kaçınma dahil olmak üzere birçok hücresel fonksiyona katıldığı bilinen oldukça dinamik bir yapı üretir. Peptidoglikan içindeki varyasyonu anlamak için, genel yapı kurucu parçalarına (muropeptitler olarak bilinir) ayrılmalı ve genel hücresel kompozisyon için değerlendirilmelidir. Peptidoglycomics, peptidoglikan kompozisyonunu ince ayrıntılarla incelemek için yüksek güçlü biyoinformatik veri analizi ile birlikte gelişmiş kütle spektrometresi kullanır. Aşağıdaki protokol, peptidoglikanın bakteri kültürlerinden saflaştırılmasını, bir sıvı kromatograf – kütle spektrometresi aracılığıyla muropeptid yoğunluk verilerinin elde edilmesini ve biyoinformatik kullanılarak peptidoglikan bileşiminin diferansiyel analizini açıklamaktadır.
Introduction
Peptidoglikan (PG), proteinler ve diğer hücresel bileşenler için yapısal destek sağlarken, hücre morfolojisini korumaya yarayan bakterilerin tanımlayıcı bir özelliğidir 1,2. PG’nin omurgası alternatif β-1,4’e bağlı N-asetil muramik asit (MurNAc) ve N-asetil glukozamin (GlcNAc)1,2’den oluşur. Her MurNAc, bitişik disakkarit bağlantılı peptitlere çapraz bağlanabilen ᴅ-laktil kalıntısına bağlı kısa bir peptide sahiptir (Şekil 1A, B). Bu çapraz bağlama, tüm hücreyi kapsayan ve genellikle sakkül olarak adlandırılan ağ benzeri bir yapı üretir (Şekil 1C). PG sentezi sırasında, öncüller sitoplazmada üretilir ve sitoplazmik membran boyunca flippaslar tarafından taşınır. Öncüller daha sonra sırasıyla glikosidik ve peptid bağlarını üreten transglikozilaz ve transpeptidaz enzimleri tarafından olgun PG’ye dahil edilir3. Bununla birlikte, bir kez monte edildikten sonra, büyüme ve bölünme de dahil olmak üzere bir dizi hücresel işlemi gerçekleştirmek için PG’yi değiştiren ve / veya bozan bakteriler tarafından üretilen çok sayıda enzim vardır. Ek olarak, PG’nin çeşitli modifikasyonlarının, hücre sinyalizasyonu, antimikrobiyal direnç ve konakçı immün kaçınma4 ile ilişkili olan suş, büyüme koşulları ve çevresel strese özgü adaptasyonlar sağladığı gösterilmiştir. Örnek olarak, yaygın bir modifikasyon, MurNAc üzerine, PG 4,5,6’yı bozan konakçı tarafından üretilen lizozim enzimlerine glikan β-1,4 bağlantılarına erişimi sınırlayarak direnç kazandıran bir C6 asetil grubunun eklenmesidir. Enterokoklarda, peptit yan zincirinin ᴅ-Ala terminalinin ᴅ-Lac ile değiştirilmesi, antimikrobiyal, vankomisin 7,8’e karşı daha büyük bir direnç sağlar.
PG izolasyonu ve saflaştırma için genel prosedür, 1960’larda tanımlandığından beri nispeten değişmeden kalmıştır9. Bakteriyel membranlar SDS ile ısıl işlemle çözülür, ardından bağlı proteinlerin, glikolipidlerin ve kalan DNA’nın enzimatik olarak uzaklaştırılması sağlanır. Saflaştırılmış bozulmamış sakkül daha sonra GlcNAc ve MurNAc arasındaki β-1,4 bağlantısının hidrolizi ile bireysel bileşenlere sindirilebilir. Bu sindirim, herhangi bir yapısal modifikasyon ve / veya çapraz bağ bozulmadan GlcNAc-MurNAc disakkaritleri üretir ve muropeptitler olarak adlandırılır (Şekil 1B).
PG’nin bileşimsel analizi başlangıçta her bir muropeptidi saflaştırmak için yüksek basınçlı sıvı kromatografik separasyonu (HPLC) yoluyla gerçekleştirildi ve ardından muropeptitlerin manuel olarak tanımlanması10,11 yapıldı. O zamandan beri bunun yerini, algılama hassasiyetini artıran ve her bir muropeptidi saflaştırmanın manuel iş yükünü azaltan sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi (LC-MS) almıştır. Bununla birlikte, muropeptitlerin manuel olarak tanımlanmasının zaman alıcı ve karmaşık doğası, yapılan çalışmaların sayısını azaltarak sınırlayıcı bir faktör olarak kalmıştır. Son yıllarda “omik” teknolojilerin ortaya çıkmasıyla birlikte, otomatik LC-MS özellik ekstraksiyonu, çok büyük veri kümelerinden karmaşık örneklerdeki bireysel bileşiklerin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan güçlü bir araç haline gelmiştir. Özellikler tanımlandıktan sonra, biyoinformatik yazılım, karmaşık veri kümesi arasındaki minimum farklılıkları bile izole eden ve bunları kullanıcıya grafiksel olarak görüntüleyen diferansiyel analiz kullanarak örnekler arasındaki varyasyonu istatistiksel olarak karşılaştırır. PG kompozisyonunun analizi için özellik ekstraksiyon yazılımının uygulanması daha yeni keşfedilmeye başlanmıştır 12,13,14 ve biyoinformatik analiz 12 ile birleştirilmiştir. Tam otomatik tanımlamaya izin veren peptid parçalanmasını öngören hazır protein veritabanlarından yararlanan proteomik analizin aksine, peptidoglycomics için şu anda parçalanma kütüphanesi yoktur. Bununla birlikte, özellik ekstraksiyonu, muropeptid tanımlamasını tahmin etmek için bilinen ve tahmin edilen yapısal veritabanlarıyla birleştirilebilir12. Burada, PG kompozisyonunun otomatik tanımlanması ve biyoinformatik diferansiyel analizi için bir muropeptid kütüphanesi ile birlikte LC-MS tabanlı özellik ekstraksiyonunun kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz (Şekil 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, peptidoglikanı bakteri kültürlerinden arındırmak, LC-MS tespiti için işlem yapmak ve biyoinformatik teknikleri kullanarak kompozisyonu analiz etmek için bir yöntem açıklamaktadır. Burada, Gram-negatif bakterilere odaklanıyoruz ve Gram-pozitif bakterilerin analizini sağlamak için bazı hafif değişiklikler gerekecektir.
Muropeptitlerin hazırlanması, 1960’larda ilk kez üretildiğinden beri neredeyse aynı kalmıştır 9,11,15.<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu protokolün rafine edilmesindeki katkılarından dolayı Dr. Jennifer Geddes-McAlister ve Dr. Anthony Clarke’a teşekkür eder. Bu çalışma, CIHR’den C.M.K’ya (PJT 156111) verilen işletme hibeleri ile desteklendi ve E.M.A. Rakamları’na verilen NSERC Alexander Graham Bell CGS D, BioRender.com’da oluşturuldu.
Materials
| Equipment | |||
| C18 reverse phase column – AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) | Agilent | LC-MS data acquisition | |
| Heating mantle controller, Optichem | Fisher | 50-401-788 | for 4% SDS boil |
| Heating Mantle, 1000mL Hemispherical | Fisher | CG1000008 | for 4% SDS boil |
| Incubator, 37°C | for sacculi purification and MS sample prep | ||
| Leibig condenser, 300MM 24/40, | Fisher | CG121805 | for 4% SDS boil |
| Lyophilizer | Labconco | for lyophilization of sacculi | |
| Magentic stirrer | Fisher | 90-691-18 | for 4% SDS boil |
| mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 | Aglient | LC-MS data acquisition | |
| microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm | Fisher | 50-197-9573 | cleanup of sample before MS injection |
| Retort stand | Fisher | 12-000-102 | for 4% SDS boil |
| Retort clamp | Fisher | S02629 | for 4% SDS boil |
| round bottom flask – 1 liter pyrex | Fisher | 07-250-084 | for 4% SDS boil |
| Sonicator model 120 | Fisher | FB120 | for sacculi purification |
| Sonicator – micro tip | Fisher | FB4422 | for sacculi purification |
| Ultracentrifuge | Beckman | sacculi wash steps | |
| Ultracentrifuge bottles, Ti45 | Fisher | NC9691797 | sacculi wash steps |
| Water supply | City | for water cooled condenser | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgesoft | molecular editor for muropeptide fragmentation prediction | |
| Excel | Microsoft | viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc. | |
| MassHunter Acquisition | Aglient | running QTOF instrument | |
| MassHunter Mass Profiler Professional | Aglient | bioinformatic differential analysis | |
| MassHunter Personal Compound Database and Library Manager | Aglient | muropeptide m/z MS database | |
| MassHunter Profinder | Aglient | recursive feature extraction | |
| MassHunter Qualitative analysis | Aglient | viewing MS and MS/MS chromatograms | |
| Prism | Graphpad | Graphing software | |
| Perseus | Max Plank Institute of Biochemistry | 1D annotation | |
| Material | |||
| Acetonitrile | Fisher | A998-4 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637 | |
| Amylase | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Boric acid | Fisher | BP168-1 | |
| DNase | Fisher | EN0521 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| LC-MS tuning mix – HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Nitrogen gas (>99% purity) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Phosphoric acid | Fisher | A242 | |
| Pronase E from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNase | Fisher | EN0531 | |
| Sodium azide | Fisher | S0489 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318 | |
| Sodium Phosphate (dibasic) | Fisher | S373 | |
| Sodium Phosphate (monobasic) | Fisher | S369 | |
| Stains-all | Sigma-Aldrich | E9379 |
References
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
- Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
- Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
- Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
- Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
- Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
- Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
- Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
- Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
- Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
- van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
- Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
- Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
- Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
- Rusconi, F., Douard Valton, &. #. 2. 0. 1. ;., Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
- Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
- Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
- Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, 12 (2012).
- Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
- Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
- Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
- Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
- Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
- Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
- Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
- De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
- Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie – International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
- Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
- Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).
