Análisis semicuantitativo de peptidoglicano por cromatografía líquida, espectrometría de masas y bioinformática
Summary
Este protocolo cubre un análisis detallado de la composición de peptidoglicanos utilizando espectrometría de masas de cromatografía líquida junto con extracción avanzada de características y software de análisis bioinformático.
Abstract
El peptidoglicano es un componente importante de las paredes celulares bacterianas y un objetivo celular común para los antimicrobianos. Aunque los aspectos de la estructura del peptidoglicano están bastante conservados en todas las bacterias, también existe una variación considerable entre los grampositivos / negativos y entre las especies. Además, existen numerosas variaciones, modificaciones o adaptaciones conocidas al peptidoglicano que pueden ocurrir dentro de una especie bacteriana en respuesta a la fase de crecimiento y / o estímulos ambientales. Estas variaciones producen una estructura altamente dinámica que se sabe que participa en muchas funciones celulares, incluido el crecimiento / división, la resistencia a los antibióticos y la evitación de la defensa del huésped. Para comprender la variación dentro del peptidoglicano, la estructura general debe descomponerse en sus partes constitutivas (conocidas como muropéptidos) y evaluarse para determinar la composición celular general. La peptidoglicómica utiliza espectrometría de masas avanzada combinada con análisis de datos bioinformáticos de alta potencia para examinar la composición de peptidoglicano con gran detalle. El siguiente protocolo describe la purificación de peptidoglicano de cultivos bacterianos, la adquisición de datos de intensidad de muropéptidos a través de un cromatógrafo líquido-espectrómetro de masas y el análisis diferencial de la composición de peptidoglicano utilizando bioinformática.
Introduction
El peptidoglicano (PG) es una característica definitoria de las bacterias que sirve para mantener la morfología celular, al tiempo que proporciona soporte estructural para proteínas y otros componentes celulares 1,2. La columna vertebral de PG está compuesta por ácido murámico N-acetil ligado a β-1,4 (MurNAc) y N-acetilglucosamina (GlcNAc)1,2. Cada MurNAc posee un péptido corto unido al residuo ᴅ-lactilo que puede ser reticulado a péptidos adyacentes ligados a disacáridos (Figura 1A, B). Esta reticulación produce una estructura similar a una malla que abarca toda la célula y a menudo se denomina sáculo (Figura 1C). Durante la síntesis de PG, los precursores se generan en el citoplasma y se transportan a través de la membrana citoplasmática por flippasas. Los precursores son incorporados posteriormente al PG maduro por las enzimas transglicosilasa y transpeptidasa, que producen los enlaces glucosídico y peptídico, respectivamente3. Sin embargo, una vez ensambladas, hay numerosas enzimas producidas por las bacterias que modifican y / o degradan el PG para llevar a cabo una serie de procesos celulares, incluyendo el crecimiento y la división. Además, se ha demostrado que varias modificaciones de la PG confieren adaptaciones específicas a la cepa, las condiciones de crecimiento y el estrés ambiental, que han sido implicadas en la señalización celular, la resistencia a los antimicrobianos y la evasión inmune del huésped4. Como ejemplos, una modificación común es la adición de un grupo acetilo C6 en el MurNAc que confiere resistencia al limitar el acceso a los enlaces glicano β-1,4 a las enzimas lisozima producidas por el huésped que degradan PG 4,5,6. En Enterococos, la sustitución del ᴅ-Ala terminal de la cadena lateral peptídica por ᴅ-Lac confiere una mayor resistencia al antimicrobiano vancomicina 7,8.
El procedimiento general para el aislamiento y purificación de PG se ha mantenido relativamente sin cambios desde que se describió en la década de 19609. Las membranas bacterianas se disuelven a través del tratamiento térmico con SDS, seguido de la eliminación enzimática de proteínas unidas, glicolípidos y ADN restante. El sáculo intacto purificado puede ser posteriormente digerido en los componentes individuales por hidrólisis del enlace β-1,4 entre GlcNAc y MurNAc. Esta digestión produce disacáridos GlcNAc-MurNAc con cualquier modificación estructural y/o enlaces cruzados intactos y se denominan muropéptidos (Figura 1B).
El análisis composicional de PG se realizó inicialmente a través de separación cromatográfica líquida de alta presión (HPLC) para purificar cada muropéptido, seguido de la identificación manual de los muropéptidos10,11. Desde entonces, esto ha sido reemplazado por la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida (LC-MS), que aumenta la sensibilidad de detección y disminuye la carga de trabajo manual de purificar cada muropéptido individual. Sin embargo, la naturaleza lenta y compleja de la identificación manual de muropéptidos ha seguido siendo un factor limitante, reduciendo el número de estudios realizados. En los últimos años, con la aparición de tecnologías “ómicas”, la extracción automatizada de características LC-MS se ha convertido en una herramienta poderosa, que permite la detección e identificación rápidas de compuestos individuales en muestras complejas de conjuntos de datos muy grandes. Una vez que se identifican las características, el software bioinformático compara estadísticamente la variación entre muestras utilizando análisis diferencial aislando incluso las diferencias mínimas entre el conjunto de datos complejo y mostrándolas gráficamente al usuario. La aplicación del software de extracción de características para el análisis de la composición de PG apenas ha comenzado a ser explorada 12,13,14 y acoplada al análisis bioinformático 12. A diferencia del análisis proteómico que se beneficia de las bases de datos de proteínas fácilmente disponibles que predicen la fragmentación de péptidos que permiten una identificación totalmente automatizada, actualmente no existe una biblioteca de fragmentación para peptidoglycomics. Sin embargo, la extracción de características se puede acoplar con bases de datos estructurales conocidas y predichas para predecir la identificación de muropéptidos12. Aquí presentamos un protocolo detallado para el uso de la extracción de características basada en LC-MS combinada con una biblioteca de muropéptidos para la identificación automatizada y el análisis diferencial bioinformático de la composición de PG (Figura 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método para purificar peptidoglicano de cultivos bacterianos, procesar para la detección de LC-MS y analizar la composición utilizando técnicas bioinformáticas. Aquí, nos centramos en las bacterias gramnegativas y se requerirá una ligera modificación para permitir el análisis de las bacterias grampositivas.
La preparación de muropéptidos se ha mantenido prácticamente igual desde que se produjo por primera vez en la década de 1960 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jennifer Geddes-McAlister y al Dr. Anthony Clarke por sus contribuciones en el perfeccionamiento de este protocolo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones operativas del CIHR otorgadas a C.M.K (PJT 156111) y un NSERC Alexander Graham Bell CGS D otorgado a E.M.A. Las figuras se crearon en BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| C18 reverse phase column – AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) | Agilent | LC-MS data acquisition | |
| Heating mantle controller, Optichem | Fisher | 50-401-788 | for 4% SDS boil |
| Heating Mantle, 1000mL Hemispherical | Fisher | CG1000008 | for 4% SDS boil |
| Incubator, 37°C | for sacculi purification and MS sample prep | ||
| Leibig condenser, 300MM 24/40, | Fisher | CG121805 | for 4% SDS boil |
| Lyophilizer | Labconco | for lyophilization of sacculi | |
| Magentic stirrer | Fisher | 90-691-18 | for 4% SDS boil |
| mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 | Aglient | LC-MS data acquisition | |
| microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm | Fisher | 50-197-9573 | cleanup of sample before MS injection |
| Retort stand | Fisher | 12-000-102 | for 4% SDS boil |
| Retort clamp | Fisher | S02629 | for 4% SDS boil |
| round bottom flask – 1 liter pyrex | Fisher | 07-250-084 | for 4% SDS boil |
| Sonicator model 120 | Fisher | FB120 | for sacculi purification |
| Sonicator – micro tip | Fisher | FB4422 | for sacculi purification |
| Ultracentrifuge | Beckman | sacculi wash steps | |
| Ultracentrifuge bottles, Ti45 | Fisher | NC9691797 | sacculi wash steps |
| Water supply | City | for water cooled condenser | |
| Software | |||
| Chemdraw | Cambridgesoft | molecular editor for muropeptide fragmentation prediction | |
| Excel | Microsoft | viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc. | |
| MassHunter Acquisition | Aglient | running QTOF instrument | |
| MassHunter Mass Profiler Professional | Aglient | bioinformatic differential analysis | |
| MassHunter Personal Compound Database and Library Manager | Aglient | muropeptide m/z MS database | |
| MassHunter Profinder | Aglient | recursive feature extraction | |
| MassHunter Qualitative analysis | Aglient | viewing MS and MS/MS chromatograms | |
| Prism | Graphpad | Graphing software | |
| Perseus | Max Plank Institute of Biochemistry | 1D annotation | |
| Material | |||
| Acetonitrile | Fisher | A998-4 | |
| Ammonium acetate | Fisher | A637 | |
| Amylase | Sigma-Aldrich | A6380 | |
| Boric acid | Fisher | BP168-1 | |
| DNase | Fisher | EN0521 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | 27001-500ML-R | |
| LC-MS tuning mix – HP0321 | Agilent | G1969-85000 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Nitrogen gas (>99% purity) | Praxair | NI 5.0UH-T | |
| Phosphoric acid | Fisher | A242 | |
| Pronase E from Streptomyces griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| RNase | Fisher | EN0531 | |
| Sodium azide | Fisher | S0489 | |
| Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 452890 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166 | |
| Sodium hydroxide | Fisher | S318 | |
| Sodium Phosphate (dibasic) | Fisher | S373 | |
| Sodium Phosphate (monobasic) | Fisher | S369 | |
| Stains-all | Sigma-Aldrich | E9379 |
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