Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

Пептидогликан (ПГ) является определяющей характеристикой бактерий, которая служит для поддержания морфологии клеток, обеспечивая при этом структурную поддержку белков и других клеточных компонентов ^1,2. Основу ПГ составляют чередующиеся β-1,4-связанные N-ацетилмурамовая кислота (MurNAc) и N-ацетилглюкозамин (GlcNAc)^1,2. Каждый MurNAc обладает коротким пептидом, связанным с ᴅ-лактильным остатком, который может быть сшит с соседними пептидами, связанными с дисахаридами (рис. 1A, B). Эта сшивка создает сетчатую структуру, которая охватывает всю клетку и часто называется саккулюсом (рис. 1C). Во время синтеза PG предшественники образуются в цитоплазме и транспортируются через цитоплазматическую мембрану флиппазами. Предшественники впоследствии включаются в зрелый PG ферментами трансгликозилазы и транспептидазы, которые продуцируют гликозидные и пептидные связи соответственно³. Однако после сборки бактерии вырабатывают множество ферментов, которые модифицируют и / или разрушают PG для выполнения ряда клеточных процессов, включая рост и деление. Кроме того, было показано, что различные модификации PG придают адаптации, специфичные для штамма, условий роста и стресса окружающей среды, которые участвуют в клеточной сигнализации, устойчивости к противомикробным препаратам и уклонении от иммунитета хозяина⁴. В качестве примера распространенной модификацией является добавление ацетильной группы C6 к MurNAc, которая придает резистентность, ограничивая доступ к гликановым β-1,4 связям с ферментами лизоцима, продуцируемыми хозяином, которые разрушают PG ^4,5,6. У энтерококков замена концевого ᴅ-Ala пептидной боковой цепи на ᴅ-Lac придает большую устойчивость к противомикробному препарату ванкомицину ^7,8.

Общая процедура выделения и очистки PG осталась относительно неизменной с тех пор, как она была описана в 1960-х годах⁹. Бактериальные мембраны растворяются путем термической обработки SDS с последующим ферментативным удалением связанных белков, гликолипидов и оставшейся ДНК. Очищенный интактный саккулус может быть впоследствии расщеплен на отдельные компоненты путем гидролиза связи β-1,4 между GlcNAc и MurNAc. В результате этого разложения образуются дисахариды GlcNAc-MurNAc с любыми структурными изменениями и/или неповрежденными поперечными связями, которые называются муропептидами (рис. 1B).

Композиционный анализ PG первоначально проводился с помощью жидкостного хроматографического разделения под высоким давлением (ВЭЖХ) для очистки каждого муропептида с последующей ручной идентификацией муропептидов^10,11. С тех пор она была заменена тандемной масс-спектрометрией жидкостной хроматографии (LC-MS), которая повышает чувствительность обнаружения и снижает ручную нагрузку на очистку каждого отдельного муропептида. Однако трудоемкий и сложный характер ручной идентификации муропептидов остается ограничивающим фактором, сокращающим количество проводимых исследований. В последние годы, с появлением «омических» технологий, автоматизированная экстракция признаков LC-MS стала мощным инструментом, позволяющим быстро обнаруживать и идентифицировать отдельные соединения в сложных образцах из очень больших наборов данных. После того, как признаки идентифицированы, биоинформационное программное обеспечение статистически сравнивает различия между образцами, используя дифференциальный анализ, выделяя даже минимальные различия между сложным набором данных и отображая их графически для пользователя. Применение программного обеспечения для извлечения признаков для анализа композиции PG только начало изучаться 12,13,14 и связано с биоинформационным анализом ¹². В отличие от протеомного анализа, который извлекает выгоду из легкодоступных баз данных белков, которые предсказывают фрагментацию пептидов, что позволяет полностью автоматизировать идентификацию, в настоящее время не существует библиотеки фрагментации для пептидогликомиксов. Тем не менее, выделение признаков может быть связано с известными и прогнозируемыми структурными базами данных для прогнозирования идентификации муропептидов¹². Здесь мы представляем подробный протокол использования экстракции признаков на основе LC-MS в сочетании с библиотекой муропептидов для автоматизированной идентификации и биоинформатического дифференциального анализа состава PG (рис. 2).