Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

O peptidoglicano (PG) é uma característica definidora de bactérias que serve para manter a morfologia celular, ao mesmo tempo em que fornece suporte estrutural para proteínas e outros componentes celulares ^1,2. A espinha dorsal do PG é composta pelo ácido N-acetil murâmico ligado ao β-1,4 (MurNAc) e N-acetilglucosamina (GlcNAc)^1,2. Cada MurNAc possui um peptídeo curto ligado ao resíduo ᴅ-lactílico que pode ser reticulado com peptídeos adjacentes ligados ao dissacarídeo (Figura 1A,B). Essa reticulação produz uma estrutura semelhante a uma malha que abrange toda a célula e é frequentemente referida como um sáculo (Figura 1C). Durante a síntese de PG, precursores são gerados no citoplasma e transportados através da membrana citoplasmática por flippases. Os precursores são posteriormente incorporados à PG madura pelas enzimas transglicosilase e transpeptidase, que produzem as ligações glicosídica e peptídica, respectivamente³. No entanto, uma vez montadas, existem inúmeras enzimas produzidas pelas bactérias que modificam e/ou degradam o PG para realizar uma série de processos celulares, incluindo crescimento e divisão. Além disso, várias modificações do PG têm demonstrado conferir adaptações específicas à linhagem, condições de crescimento e estresse ambiental, que têm sido implicadas na sinalização celular, resistência antimicrobiana e evasão imune do hospedeiro⁴. Como exemplos, uma modificação comum é a adição de um grupo acetila C6 no MurNAc que confere resistência limitando o acesso às ligações glicânicas β-1,4 às enzimas lisozimas produzidas pelo hospedeiro que degradam PG ^4,5,6. Em Enterococos, a substituição do ᴅ-Ala terminal da cadeia lateral do peptídeo por ᴅ-Lac confere maior resistência ao antimicrobiano, a vancomicina ^7,8.

O procedimento geral de isolamento e purificação do PG permaneceu relativamente inalterado desde que foi descrito^{na década de} 19609. As membranas bacterianas são dissolvidas através de tratamento térmico com SDS, seguido de remoção enzimática de proteínas ligadas, glicolipídios e DNA remanescente. O sáculo intacto purificado pode ser posteriormente digerido nos componentes individuais por hidrólise da ligação β-1,4 entre GlcNAc e MurNAc. Essa digestão produz dissacarídeos GlcNAc-MurNAc com quaisquer modificações estruturais e/ou ligações cruzadas intactas e são chamados de muropeptídeos (Figura 1B).

A análise composicional do PG foi inicialmente realizada por separação por cromatografia líquida de alta pressão (CLAE) para purificação de cada muropeptídeo, seguida da identificação manual dos muropeptídeos^10,11. Desde então, isso foi substituído pela cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS), que aumenta a sensibilidade de detecção e diminui a carga de trabalho manual de purificação de cada muropeptídeo individual. Entretanto, a demora e complexidade da identificação manual de muropeptídeos tem permanecido um fator limitante, reduzindo o número de estudos realizados. Nos últimos anos, com o surgimento de tecnologias “ômicas”, a extração automatizada de recursos LC-MS tornou-se uma ferramenta poderosa, permitindo a rápida detecção e identificação de compostos individuais em amostras complexas de conjuntos de dados muito grandes. Uma vez identificadas as características, um software de bioinformática compara estatisticamente a variação entre as amostras por meio da análise diferencial, isolando diferenças mínimas entre o complexo conjunto de dados e exibindo-as graficamente ao usuário. A aplicação de softwares de extração de características para análise da composição de PG apenas começou a ser explorada 12,13,14 e acoplada à análise bioinformática ¹². Ao contrário da análise proteômica, que se beneficia dos bancos de dados de proteínas prontamente disponíveis que predizem a fragmentação peptídica, permitindo a identificação totalmente automatizada, nenhuma biblioteca de fragmentação existe atualmente para peptidoglicômica. No entanto, a extração de características pode ser acoplada a bancos de dados estruturais conhecidos e previstos para prever a identificação de muropeptídeos¹². Aqui apresentamos um protocolo detalhado para o uso da extração de características baseada em LC-MS combinada com uma biblioteca de muropeptídeos para identificação automatizada e análise diferencial bioinformática da composição PG (Figura 2).