Analisi semi-quantitativa del peptidoglicano mediante cromatografia liquida spettrometria di massa e bioinformatica

Il peptidoglicano (PG) è una caratteristica distintiva dei batteri che serve a mantenere la morfologia cellulare, fornendo supporto strutturale per proteine e altri componenti cellulari ^1,2. La spina dorsale del PG è composta dall’acido N-acetil muramico (MurNAc) alternato β-1,4-e dalla N-acetil glucosamina (GlcNAc)^1,2. Ogni MurNAc possiede un peptide corto legato al residuo ᴅ-lattile che può essere reticolato con peptidi adiacenti legati al disaccaride (Figura 1A,B). Questa reticolazione produce una struttura a maglia che comprende l’intera cellula ed è spesso indicata come sacculus (Figura 1C). Durante la sintesi di PG, i precursori vengono generati nel citoplasma e trasportati attraverso la membrana citoplasmatica dalle flippasi. I precursori sono successivamente incorporati nel PG maturo dagli enzimi transglicosilasi e transpeptidasi, che producono rispettivamente i legami glicosidici e peptidici³. Tuttavia, una volta assemblati, ci sono numerosi enzimi prodotti dai batteri che modificano e / o degradano il PG per svolgere una serie di processi cellulari, tra cui la crescita e la divisione. Inoltre, varie modifiche del PG hanno dimostrato di conferire adattamenti specifici per la deformazione, le condizioni di crescita e lo stress ambientale, che sono stati implicati nella segnalazione cellulare, nella resistenza antimicrobica e nell’evasione immunitaria dell’ospite⁴. Ad esempio, una modifica comune è l’aggiunta di un gruppo acetilico C6 sul MurNAc che conferisce resistenza limitando l’accesso ai legami glicani β-1,4 agli enzimi lisozima prodotti dall’ospite che degradano PG ^4,5,6. Negli enterococchi, la sostituzione del terminale ᴅ-Ala della catena laterale peptidica con ᴅ-Lac conferisce una maggiore resistenza all’antimicrobico, vancomicina ^7,8.

La procedura generale per l’isolamento e la purificazione del PG è rimasta relativamente invariata da quando è stata descritta negli anni 1960⁹. Le membrane batteriche vengono sciolte attraverso il trattamento termico con SDS, seguito dalla rimozione enzimatica delle proteine legate, dei glicolipidi e del DNA rimanente. Il sacculus intatto purificato può essere successivamente digerito nei singoli componenti mediante idrolisi del legame β-1,4 tra GlcNAc e MurNAc. Questa digestione produce disaccaridi GlcNAc-MurNAc con eventuali modifiche strutturali e/o legami incrociati intatti e sono chiamati muropeptidi (Figura 1B).

L’analisi composizionale del PG è stata inizialmente condotta attraverso la separazione cromatografica liquida ad alta pressione (HPLC) per purificare ciascun muropeptide seguita dall’identificazione manuale dei muropeptidi^10,11. Da allora questo è stato sostituito dalla spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida (LC-MS), che aumenta la sensibilità di rilevamento e diminuisce il carico di lavoro manuale di purificazione di ogni singolo muropeptide. Tuttavia, la natura lunga e complessa dell’identificazione manuale dei muropeptidi è rimasta un fattore limitante, riducendo il numero di studi condotti. Negli ultimi anni con l’emergere di tecnologie “omiche”, l’estrazione automatizzata delle caratteristiche LC-MS è diventata uno strumento potente, consentendo una rapida rilevazione e identificazione di singoli composti in campioni complessi da set di dati molto grandi. Una volta identificate le caratteristiche, il software bioinformatico confronta statisticamente la variazione tra i campioni utilizzando l’analisi differenziale isolando anche minime differenze tra i complessi set di dati e visualizzandoli graficamente all’utente. L’applicazione di software di estrazione di caratteristiche per l’analisi della composizione PG ha appena iniziato ad essere esplorata 12,13,14 e accoppiata all’analisi bioinformatica ¹². A differenza dell’analisi proteomica che beneficia dei database proteici prontamente disponibili che prevedono la frammentazione dei peptidi consentendo un’identificazione completamente automatizzata, attualmente non esiste una libreria di frammentazione per i peptidoglycomics. Tuttavia, l’estrazione delle caratteristiche può essere accoppiata con database strutturali noti e previsti per prevedere l’identificazione del muropeptide¹². Qui presentiamo un protocollo dettagliato per l’uso dell’estrazione di caratteristiche basata su LC-MS combinata con una libreria di muropeptidi per l’identificazione automatizzata e l’analisi differenziale bioinformatica della composizione PG (Figura 2).